p>От 0 до -Mc-

Ot 0 до -+4°

-М°

+4°

Щелочные фос-фатазы, кислые фосфата-зы

То же

Щелочная фосфатаза в мазках крови

Кислые гидролазы

То же

Кислая фосфатаза в культурах тканей

Холинэстеразы

Световая

Электронная

Световая

Заливка в парафин

Перенесение маленьких кусочков ткани после фиксации 24 ч или дольше при температуре от 0 до +4°С в 0,88 М сахарозу с добавлением 1% гумми акации

Таблица 9

Действие фиксации на различные оксндоредуктазы (Chayen a. Mitarb.)

Фермент Фиксация Продолжительность фиксации, ч Температура фиксации, "С Последующая обработка Остаточная активность, процент от исходной активности в нефиксированном материале

НАДФН-тетразолийредук- Кальций- 12 От 0 до 5-25

таза формол +4°

НАДФН-тетразолийредук- » 12 То же 4-10

таза »

Цитохромоксидаза Заморажи- Заливка в парафин 56

вание -

высуши-

вание

Цитохромоксидаза То же Заливка в парафин 0

30 мин при +60° С

Сукцинатдегидрогеназа Формаль- 2-4 +4° 0

дегид 60

Сукцинатдегидрогеназа Ацетон 24 +4° Сукциноксидаза Заморажи- Заливка 37

вание - высу- в парафин 30 мин

шивание при +60°С

Сукциноксидаза То же 0

Таблица 10

Фиксирующие вещества для электронно-микроскопического выявления ферментов (по Janigan, с изменениями)

Фиксирующее вещество Количество, мл Сахароза1, г Фосфатный или какодилатный буфер Конечный объем, мл Конечная концентрация, % Примечание

Формальдегид 40% 5 3,76 0,1 М, рН 7,4 50 4 Можно использовать

Глутаральдегид 25% 13 0,1 М, рН 7,2 50 6,5 в конечной концентра-

Акролеин 100% , 5 - 0,1 М, рН 7,6 50 10 ции до 2%

Метакролеин 100% 2,5 3,76 0,1 М, рН 7,6 50 4

Кротональдегид 100% 5 7,52 0,1 М, рН 7,4 50 10

Глиоксаль 6,1 3,76 0,2 М, рН 6,5 50 4

Оксиадипинальдегид 22,54 27,7 7,52 0,1 М, рН 7,5 50 12,5

Сахарозу растворить в буфере, прежде чем довести фиксирующий раствор до конечного объема. Продолжительность фиксации для кусоч -ков толщиной 3-4 мм при +4° С 2-6 ч.

2. Методы гистохимии S3

провождается утратой ферментативной активности. Степень инактивации можно уменьшить, снизив концентрацию глутаральдегида до 1,5—3%. Моноальдегиды—мета-кролеин, кротональдегид и акролеин—менее пригодны для выявления ферментативной активности на электронно-гистохимическом уровне.

Специфические действия фиксирующих веществ на ферментативную активность трудно определить с помощью гистохимических методов. Для этой цели требуются сравнительные биохимические исследования. Необходимо помнить, что физические и химические свойства целого ряда ферментов меняются в зависимости от того, связаны ли они с субклеточными структурами или находятся в изолированном виде.

2.2. ГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ

Имеющиеся в нашем распоряжении гистохимические реакции охватывают методы для выявления белков и аминокислот, углеводов, нуклеиновых кислот, липидов, биогенных аминов, неорганических веществ и ферментов. Поскольку выявление ферментативной активности во многих отношениях отличается от выявления веществ, ферменты рассматриваются отдельно от белков. В специальные методические разделы выделены также радиоавтография и иммуногистохимия.

2.2.1. ТИПЫ РЕАКЦИЙ

''Лишь в редких случах удается выявить отдельные вещества одной лишь микроскопией, без какой-либо окраски (таковы, например, меланин и липохром). Как правило, для выявления необходимо получить хорошо оптически различимый в большинстве случаев окрашенный продукт.

Это достигается с помощью одноэтапной или двух-этапной реакции. Если при одноэтапной реакции выявляемое вещество непосредственно превращается в окрашенный продукт, то при двухэтапных реакциях первый этап ведет к образованию неокрашенного продукта, который переводится в окрашенный лишь на втором этапе. Для электронно-микроскопического выявления веществ

54 2. Методы гистохимии

и ферментативной активности необходимо применять методы контрастирования—повышения электронной плотности продукта реакции.

Возможность систематизации реакций, ведущих к образованию окрашенного продукта, продемонстрирована в табл. 11.

Обзор типов реакций, используемых для

Таблица различных веществ (Алки

Тип реакции

Источник

Применение (пример)

Выявляемое веш)

Микрохимические

Образование красителя

Электростатическое окрашивание

Растворение красителя

Неорганическая аналитическая химия

Реакции замещения, ведущие к образованию окрашенного продукта

Методы электрохимии

Физико-химические процессы растворения

Реакция образования берлинской лазури

Реакция сульфид — серебро

ШИК-реакция Реакция Фёль-гена

Определение ба-зофилии

Окрашивание су-дановыми красителями

Железо

Тяжелые метал, лы

Углеводы, ДНЯ

Кислые группЫв SOjO.POsHOl

'СОО-

, Липиды

2.2.2. ПРИМЕРНЫЙ ПЛАН ГИСТОХИМИЧЕСКОЙ ПРОЦЕДУРЫ

Необходимая для выявления какого-либо вещества гистохимическая реакция состоит, как правило, из следующих этапов: фиксация ткани, приготовление замороженных или криостатных срезов или заливка ткани после соответствующей предварительной обработки и резка залитого материала, прикрепление среза к предметному стеклу, подготовка среза к гистохимической реакции, заключение среза с окрашенным продуктом реакции.

Замороженные срезы не требуют какой-либо специальной обработки. Их помещают в дистиллированную воду или непосредственно в реакционную смесь. Парафиновые же срезы необходимо перед проведением гистохимической

2. Методы гистохимии 55

Таблица 12

Среды для заливки и их применение в гистохимии

Среды

Применение и примечания

Водорастворимые Глицерин—желатина

Желатинол

Желатина — бальзам Геринга (Hering)

Пласдои С (поливинилпирроли-

дон) Среда Фарранта

(Farrant)

Безводные Нейтральный бальзам

Цедакс

DePX

Эукитт

Пригодны для заключения замороженных срезов

Среда для заключения на основе искусственных смол; хорошо подходит для заключения замороженных срезов

Среда для заключения замороженных срезов; после наложения покровного стекла на срез со средой предметное стекло следует поместить на 10 мни в термостат

Заливочная среда при окрашивании на жиры и реакциях с образованием азокрасителя

Для заключения замороженных срезов, особенно после проведения ферментативных реакций

Хорошо подходит для заключения обезвоженных препаратов

Нейтральная заливочная среда для заключения обезвоженных препаратов

Заливочная среда для обезвоженных препаратов при хорошей сохранности окрашивания; не подходит для препаратов с осадками серебра

Очень быстро высыха-ющая заливочная среда

56 2. Методы гистохимии

реакции депарафинировать (две смены ксилола, ряд спиртов убьшающей концентрации, дистиллированная вода). Для ультрагистохимических целей во многих случаях гистохимическую реакцию можно провести на кусочках ткани или же на толстых срезах перед обычным обезвоживанием и заливкой в смолу.

После проведения реакции срез для дальнейшего изучения следует заключить в подходящую среду. При этом важно, чтобы коэффициенты преломления продукта гистохимической реакции и среды, используемой для заключения, были бы близки. Для заключения срезов после проведения гистохимической реакции используются как водорастворимые, так и безводные среды (табл. 12).

3. ГИСТОХИМИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ВЕЩЕСТВ

В практической работе часто бывает необходимо предварительное топохимическое изучение имеющихся в незнакомой ткани групп веществ. При больших изменениях в концентрациях веществ, которые могут происходить в результате экспериментальных воздействий, желательно проводить сначала более грубую предварительную оценку химического состава исследуемых клеток и тканей.

Для анализа веществ особенно пригодны групповые реакции, позволяющие провести выявление класса веществ (табл. 13 и 14). Аналогичный подход уже давно практикуется в аналитической химии, где на основании проведения реакции на группы веществ определяется химический состав данной пробы.

Таблица 13

Тшюхимические реакции для идентификации классов веществ в клетках и тканях

Класс вешества Реакция

г>елки Реакция с дииитрофторбеизолом

Углеводы ШИК-реакция

Нуклеиновые кислоты Окрашивание Метиловым зеленым—

пироиином

Липиды Окрашивание Суданом черным В

Большую группу неорганических веществ не удается охватить одной общей реакцией. Лишь в случае тяжелых металлов можно с помощью реакции сульфид — серебро выделить их из общей группы неорганических веществ.

Таблица 14

Тонохимическне методы определения класса неизвестного вещества (на оснопе схемы Chayen u. Mitarb.)

Неизвестное вещество

Метод определения

Класс веществ

ДНФБ-реакция

Метиловый зеле-ный-пиронин

Судановый черный В Специальные v методы

Дкролеин-Шифф Толуидиновый синий (рН 6,0)

Выявление тирозина

ШИК-реакция

Бензпирен—кофеин Кислый гематеин

Белки

Кислые Углеводы Липиды компоненты (например, нуклеиновые кислоты)

Неорганические вещества, пигменты и т. п.

3. Гистохимическая диагностика веществ 59

3.1. ГИСТОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ОТДЕЛЬНЫХ КЛАССОВ ВЕЩЕСТВ

Помимо подобного аналитического подхода к разделению классов веществ можно провести более точную идентификацию компонентов внутри класса.

3.1.1. БЕЛКИ

После получения положительной реакции с динитро-фторбензолом можно разграничить основные, кислые и нейтральные белки путем окрашивания прочным зеленым при различных значениях рН (табл. 15). Наличие основных белков в исследуемых структурах может быть подтверждено реакцией на основные аминокислоты—аргинин и лизин, а также выявлением SH-групп. Для дальнейшей дифференцировки белков можно использовать пробу на метахромазию для общей фракции кислых белков (кислые мукопротеиды), ШИК-реакцию для выявления углеводного компонента нейтральных белков (гликопротеиды). Ли-попротеиды (гликолипиды) дают положитель