ции протонов в дыхательной цепи, различия между ними не следует преувеличивать. Так, гипотеза петель предполагает, что у некоторых редокс-переносчиков меняется значение рК при восстановлении, что приводит к захвату двух

Дыхательные цепи

115

протонов на два электрона из матрикса. Последующее реокисле-ние переносчика вызывает понижение рК и освобождение протонов во внешнюю среду. Такие же направленные изменения рК являются непременной частью любого гипотетического механизма конформационной помпы. В этом случае, однако, не требуется предполагать присоединения протонов и электронов к одному и тому же компоненту. Напротив, редокс-компонент должен быть отделен от протонпереносящего. Свободная энергия, освобождаемая при редокс-переходе, передается с помощью конформационных изменений ко второму компоненту, который в результате меняет конформацию и рК. Поскольку этот компонент может не иметь редокс-свойств, выбор кандидатов оказывается неограниченным. Отпадают также и стехиометрические ограничения. Действительно, нет причин, почему двухэлектрон-ное восстановление переносчика не может индуцировать кон-формационный переход, приводящий к изменению рК трех или более групп в другом белке, хотя ни один из известных редокс-переносчиков и не связывает более 2Н+ на 2е~.

В конформационной помпе должны координирование происходить редокс-изменения, конформационные изменения и изменения степени протонирования групп. Следовательно, даже в простейшей модели имеется 23 = 8 гипотетических состояний, связанных взаимными переходами. Векторная транслокация протонов позволяет ограничить число возможных переходов, как это показано на рис. 5.12.

5.5. ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ И РЕКОНСТРУКЦИЯ КОМПЛЕКСОВ ДЫХАТЕЛЬНОЙ ЦЕПИ

[Обзоры: Hatefi, 1978; Hatefi et al., 1962 (выделение комплексов); Kagawa, 1972; Racker, 1979 (выделение и реконструкция)]

Использование желчных солей, таких, как холат и дезокси-холат, при низких температурах позволяет разрушать липид-липидные взаимодействия в мембранах и в то же время сохранять интактные белок-белковые комплексы. С помощью этих детергентов дыхательную цепь митохондрий можно разделить на четыре комплекса, названные комплексами I, II, III и IV (цитохром с-оксидаза). При этом сохраняется электронтранспортная активность каждого комплекса, а после встраивания этих комплексов в искусственные бислойные мембраны восстанавливается их протонпереносящая активность. С помощью фракционирования и реконструкции комплексов достигается ряд целей: 1) снижается сложность системы по сравнению с интактными митохондриями; 2) становится возможным определение минимального числа компонентов, необходимых для работы каждого участка цепи; 3) в период проверки хемиосмотической теории

1 16 Глава 5

метод реконструкции дал наиболее убедительные доказательства отсутствия необходимости прямой химической или структурной связи между дыхательной цепью и АТР-синтетазой. Так, например, оказалось, что можно «реконструировать» синтез АТР в системе, содержащей такие неродственные комплексы, как АТР-синтетаза из митохондрий сердца быка и светозависимая Н+-помпа из галобактерий (разд. 6.6), включенные в общий липид-ный бислой.

При фракционировании митохондриальной дыхательной цепи было обнаружено, что она содержит два моля комплекса IV на моль комплекса III. Комплексы I и II присутствовали в значительно меньших количествах. Изолированные комплексы легко реагрегировали. Например, в присутствии фосфолипидов и UQio комплексы I и III спонтанно агрегировали и при этом восстанавливалась NADH-цитохром с-оксидоредуктазная активность (Ragan, Heron, 1978).

Метод реконструкции был впервые разработан Рэкером и Ка-гавой. Уже после выделения чистого комплекса при реконструкциях возникает ряд технических проблем. Во-первых, после встраивания в бислой комплекс должен сохранять каталитическую активность. Во-вторых, следует учитывать, что после реконструкции протонные помпы могут быть ориентированы в мембране случайным образом, что затрудняет измерение их протон-переносящей активности. Для включения комплексов в везикулы их обычно суспендируют в смеси холата и фосфолипидов, а затем медленно удаляют детергент с помощью диализа. Везикулы с встроенными в мембрану комплексами образуются самопроизвольно. Другой метод состоит в том, что комплексы в смеси с фосфолипидами обрабатывают ультразвуком (разд. 1.4).

5.6. КОМПЛЕКС I [ NAD Н-ДЕГИДРОГЕНАЗА(ХИНОН)J

[Обзоры: Ragan, 1976 (свойства); Hatefi, 1978 (выделение)]

Комплекс I катализирует перенос двух электронов от NADH на UQio, что соответствует АЕьд^ЗЮ мВ (рис. 5.11). Он способен переносить протоны — это было показано как на интактных митохондриях, так и на реконструированной системе, где в качестве акцептора электронов использовали окисленный хинон. При окислении NAD+-3aBHCHMbrx субстратов наблюдаются более высокие соотношения Н+/0 (разд. 4.3) и ADP/0 (разд. 4.6), чем в случае сукцината, который подает электроны на UQio через комплекс II, не способный переносить протоны.

Комплекс I имеет мол. массу ~ 850 ООО и, возможно, является •самым большим белковым комплексом во внутренней мембране митохондрий. Он содержит по крайней мере 16 полипептидов,

Дыхательные цепи

117

большинство из которых не участвует непосредственно в редокс-превращениях. NADH окисляется на внутренней стороне мембраны (обращенной в матрикс) с помощью FMN-содержащего фермента —NADH-дегидрогеназы. Интактные митохондрии в отличие от вывернутых субмитохондриальных частиц не способны окислять добавленный NADH. Комплекс 1 содержит от 16 до 28 атомов Fe и кислотолабильных атомов S (намольРМ^, которые собраны в кластеры, содержащие 2 или 4 атома Fe. С помощью низкотемпературного ЭПР и редокс-потенциометрии (рис. 5.11) можно обнаружить от 4 до 7 Fe/S-центров на моль комплекса I. Все центры имеют очень низкие потенциалы полу-восстановления: от —240 до —380 мВ, за исключением центра N-2, для которого Emj——80 мВ.

Активность комплекса I может быть ингибирована ротеноном или пьерицидином А. Точное место связывания ротенона не известно. Однако, поскольку в присутствии ингибитора как FMN, так и Fe/S-центры оказываются восстановленными, можно полагать, что он блокирует последние стадии переноса электронов на UQio.

Непроникающий и неспецифический акцептор электронов — феррицианид — не взаимодействует с комплексом I в интактных митохондриях, но катализирует быстрое и нечувствительное к ротенону окисление NADH в вывернутых субмитохондриальных частицах.

5.7. КОМПЛЕКС II (СУКЦИНАТДЕГИДРОГЁНАЗА); ЭЛЕКТРОНПЕРЕНОСЯЩИЙ ФЛАВОПРОТЕИН И о-ГЛИЦЕРОФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗА

[Обзор: Hatefi, 1978 (выделение)]

Кроме комплекса I существуют еще три пути переноса электронов к UQio и комплексу III: с помощью комплекса II, переносящего электроны от сукцината, с помощью электронперенося-щего флавопротеина, который получает электроны на флавин-зависимой стадии р-окисления жирных кислот, и с помощью а-глицерофосфатдегидрогеназы, катализирующей внемитохонд-риальное окисление а-глицерофосфата до дигидроксиацетонфос-фата.

Две первые системы локализованы на внутренней стороне мембраны, а третья — на наружной. Все три являются флаво-лротеиновыми системами, переносящими электроны от субстратных пар, имеющих потенциалы полувосстановлеиия, близкие к О мВ. Как следует из термодинамики, ни одна из них не может переносить протоны.

Комплекс II состоит по крайней мере из четырех полипептидов (табл. 5.1). Два больших полипептида составляют сукцинат-дегидрогеназу. Больший из них содержит ковалентно связанный

118 Глава 5

Таблица 5.1

Функциональные комплексы дыхательной цепи в митохондриях

Комплекс

Число еубъединиц

Простетическне группы

I NADH-дегидрогеназа (хинон), мол. масса 850000 11 Сукцинатдегидрогеназа, мол. масса 97000

III UQH2-iWTOxpoM с-оксидо-редуктаза, мол. масса 280 000

IV Цитохром с-оксидаза, мол. масса 200 000

16 2

6—8 6—7

1 FMN, 16—24 атома неге-мового железа (5—7 центров)

1 FAD, 8 атомов негемо-вого железа (3 центра)

2 гема типа Ь

1 гем типа с

2 атома негемового железа (1 центр)

2 гема типа а 2 атома Си

1 Данные относительно переноса протонов (нли только электронов) цитохромоксидазой противоречивы (разд. 5.9).

Цитохромы присутствуют в цепи в следующих стехиометрнческих ссютношениях: ib-.cgc. аа, = 2 -Г2-22. Приблизительное молярное соотношение комплексов 1:11:111:1 V = 0,1:0,1: :6,5:1.

FAD и два Fe/S-центра, второй содержит еще один центр. Комплекс II содержит цитохром Ь в количестве, эквимолярном FAD, причем этот цитохром, ассоциированный с меньшими полипептидами, отличается от цитохрома Ь комплекса III (разд. 5.8). Функции цитохрома Ь комплекса II пока не выяснены.

5.8. УБИХИНОН И КОМПЛЕКС III

Jfed-КОМПЛЕКС, ИЛИ UQ-ЦИТОХРОМ с-ОКСИДОРЕДУКТАЗА)

[Обзоры: Hatefi, 1978 (выделение); Wikstrom, 1973; Papa, 1976, Rieske, 1976 (свойства)]

Хотя UQ является самым низкомолекулярным редокс-компо-нентом дыхательной цепи, вопрос о его роли остается, пожалуй, наиболее спорным. Простейшее предположение состоит в том, что этот гидрофобный кофермент играет роль «пула водорода», т. е. работает как подвижный переносчик двух Н-атомов (2Н++ + 2е"), соединяющий комплексы I и II с комплексом III. Однако гипотеза протондвижущего Q-цикла предполагает, что UQio осуществляет перенос Н-атомов внутри самого комплекса III.

Комплекс III состоит из 8 субъединиц, включая 2 моля цитохромов Ь и 1 моль цитохрома съ Долгие время считалось, что комплекс содержит цитохромы Ь двух различных типов: цитохром Ъ одного из них восстанавливается сукцинатом, а друго-

Дыхательные цепи

119

го — лишь в присутствии дитионита. Кроме того, для цитохромов Ъ этих двух типов были зарегистрированы различные спектры как в интактных митохондриях, так и в очищенном комплексе. Наконец, они имели различные потенциалы полувосстановления, и эта разница сохранялась даже в выделенных димерах цитохромов (von Jagow et al., 1978). Эти цитохромы были названы Ьк или &5б2 — цитохром, восстанавливаемый сукцинатом, и &т или &5бб — цитохром, который восстанавливается лишь ди