к положительно заряженной стороне мембраны за счет мембранного потенциала (разд. 3.4), a FCCPH переносится в направлении объема со щелочным рН за счет градиента рН на мембране (разд. 3.5). Разобщители типа FCCP работают на мембранах многих типов в концентрациях от 10_6 до

ю-9 М.

А23187

А23187 — это ионофор, несущий карбоксильные группы и проявляющий высокую специфичность в отношении двухвалентных катионов по сравнению с одновалентными. Он катализирует электронейтральный обмен Са2+ или Mg2+ на два Н+, не влияя на градиенты одновалентных ионов.

2.5.3. ПЕРЕНОСЧИКИ ПРОТОНОВ И ЗАРЯДОВ

Протонные переносчики (разобщители)

Протонные переносчики имеют протондонорные или протонакцепторные группы и способны пересекать мембрану либо в виде протониррванных кислот, либо в виде конъюги-рованных оснований (рис. 2.5). Это оказывается возможным благодаря существующей в их молекулах системе л-орбита-лей, обеспечивающей делока-лизацию заряда анионной формы и ее растворимость в липи-де. Пересекая, как челнок, мембрану, разобщители катализируют электрогенный унипорт протонов и понижают сопротивление мембраны для протонов. Возникающий при этом протонный ток приводит к короткому замыканию (разд. 4.5) и разобщению генератора

\цн+ и АТР-синтетазы. Разоб-

Транспорт ионов через сопрягающие мембраны

39

щающее действие некоторых соединений было описано задолго до появления хемиосмотической теории. Когда было показано, что большинство этих соединений работают, понижая протонное сопротивление липидного бислоя, это явилось важным указанием в пользу хемиосмотической гипотезы и против гипотезы химического сопряжения, в которой предполагалась специфическая способность разобщителей гидролизовать высокоэнергетические интермедиата.

Непрямой перенос протонов можно индуцировать при одновременном возникновении унипорта иона и электронейтрального антипорта этого иона в обмен на протон. Так, например, комбинация валиномицина и нигерицина индуцирует суммарный унипорт Н+, тогда как К+ циклически переносится через мембрану.

2.5.4. ЛИПОФИЛЬНЫЕ КАТИОНЫ И АНИОНЫ

Способность системы л-орбиталей делокализовывать заряд иона и повышать его растворимость в липиде была использована для синтеза ряда катионов и анионов, способных пересекать бислойные мембраны, не меняя заряда (рис. 2.6). Эти ионы не

Метилтрифенилфосфоний Тетрафенилборат (ТРМР+) ПГРВ")

Рис. 2.6. Примеры синтетических липофильных ионов.

являются ионофорами, так как они не действуют каталитически, а переносятся электрофоретически при образовании А гр на мембране (разд. 4.4). Липофильные катионы и анионы сыграли важную роль. Опыты, в которых наблюдалось их энергозависимое накопление в митохондриях (катионы) и вывернутых субми-тохондриальных частицах (анионы) (разд. 1.4), позволили исключить возможность существования специфических катионных помп, использующих высокоэнергетические интермедиаты (Sku-lachev, 1971). Впоследствии эти ионы были использованы для определения величины А гр (разд. 4.2).

40 Глава 2

2.6. ТРАНСПОРТ, КАТАЛИЗИРУЕМЫЙ БЕЛКАМИ

(Обзор: Wilbrant, 1974)

Свойства белковых систем, катализирующих транспорт через сопрягающие мембраны, обычно сильно отличаются от свойств бислойных участков как в присутствии, так и в отсутствие ионо-форов. Транспортные белки обладают многими свойствами, присущими ферментам: они проявляют стереоспецифичность, часто их можно специфически ингибировать, они генетически детерминированы. Последнее обстоятельство делает невозможной ту степень обобщения, которая применима к транспорту через би-слой. Например, если FCCP (рис. 2.5) индуцирует протонную проводимость в митохондриях, то можно смело полагать, что его эффект будет тем же в случае хлоропластов, бактерий или искусственного бислоя. В отличие от FCCP транспортный белок может быть специфическим не только для данной органеллы, но и для органеллы из определенной ткани. Например, переносчик цитрата существует в митохондриях из печени, где он участвует в переносе промежуточных соединений синтеза жирных кислот (разд. 8.3), но отсутствует в митохондриях из сердца. Иногда утверждают, что для белковых транспортных систем характерна кинетика насыщения. Хотя в некоторых случаях это может быть верным, в целом кинетика транспортных процессов настолько сложна (особенно если они зависят от мембранного потенциала), что интерпретация ее требует большой осторожности.

Самым убедительным доказательством участия белка в транспорте является существование специфических ингибиторов. Например, долгие годы считалось, что пируват проникает в митохондрии через бислой. Это вполне возможно, так как он является монокарбоновой слабой кислотой. Однако было обнаружено, что цианогидроксицинамат (разд. 8.3) специфически ингибирует транспорт. Это явилось первым строгим доказательством существования переносчика пирувата (LaNoue, Schoolworth, 1979).

Транспортные белки изучались с помощью многих подходов, что привело к появлению избытка названий, таких, как переносчики, пермеазы, портеры и транслоказы. Все они являются синонимами транспортных белков.

2.7. ДВИЖЕНИЕ ВЕЩЕСТВ ЧЕРЕЗ СОПРЯГАЮЩИЕ МЕМБРАНЫ

Суспензия, приготовленная из митохондрий, — мутная. Величина ее светорассеяния является функцией разности между коэффициентами преломления содержимого матрикса и средой. Всякий процесс, снижающий эту разницу, уменьшает и светорассеяние. Увеличение объема матрикса, вызванное входом проникающих веществ, приводит, как ни странно, к понижению светорассеяния, так как показатель преломления матрикса приближается к показателю преломления среды. Благодаря этим

Транспорт ионов через сопрягающие мембраны

41

КС1

Повышение светорассеяния

К*-

сг-

kcns

kcns

к+-

Л

CNS"

Ниг

V

к , ф *»*

FCCP *

к'-S-Z.

Ас+Н-

КАс Jus

+ Ниг

X

¦ Н*+Ас"

-Н++Ас

Рис. 2.7. Условия для набухания недышащих митохондрий. В — валиномицин; Ниг—нигерицин; Ас — ион ацетата.

изменениям можно довольно просто наблюдать за потоками веществ через внутреннюю мембрану митохондрий. Митохондрии оказываются пригодными для таких наблюдений потому, что их матрикс сильно увеличивается в объеме без разрыва внутренней мембраны просто за счет разворачивания крист. «Набухание» может приводить к разрушению наружной мембраны и выходу в раствор аденилаткиназы, локализованной в межмембранном пространстве. Светорассеяние регистрируют либо по уменьшению проходящего света в обычном спектрофотометре, либо более чувствительным методом, с помощью флуориметра, измеряя непосредственно рассеянный свет под углом 90° к падающему лучу.

Для того чтобы наблюдать набухание митохондрий в ионной среде, необходимо выполнение двух условий: во-первых, и катионы, и анионы основного осмотического компонента среды должны проникать через мембрану, во-вторых, должен сохраняться суммарный баланс переноса зарядов через мембрану. В про-

42 Глава 2

стейшем случае рассмотрим митохондрию, в которой не работает ни дыхательная цепь, ни АТР-синтетаза. В примере, приведенном на рис. 2.7, исследовалась проницаемость митохондрий печени крысы для ионов С1~ и CNS-. Митохондрии, суспендированные в 120 мМ КС1 или 120 мМ KCNS, набухали слабо. Однако это еще не указывает на низкую проницаемость внутренней мембраны для выбранных анионов, так как рассматриваемая, мембрана плохо проницаема для К+. Преодолеть этот барьер можно, индуцировав электрогенный унипорт К+ с помощью валино-мицина (разд. 2.5). Действие этого ионофора можно предсказать заранее, предполагая, что он вызывает в бислойных участках данной мембраны тот же тип проводимости, что и в искусственных бислоях. После добавления валиномицина в среде с KCNS наблюдается быстрое набухание, но оно остается медленным в присутствии КС1. Теперь можно заключить, что Внутренняя мембрана проницаема для CNS-, но не для СК Этот вывод оказывается верным, хотя и несколько преждевременным, так как не были учтены проблемы, возникающие в связи с балансом зарядов.

Чтобы учесть их, рассмотрим также набухание митохондрий в среде, содержащей ацетат калия (рис. 2.7). Чтобы исключить препятствия, связанные с низкой проницаемостью мембраны для калия, в среду добавляли ионофоры (валиномицин или нигери-цин). Видно, что скорость набухания зависит от свойств проводимости, индуцированной ионофором: нигерицин эффективен только в среде с ацетатом калия, а валиномицин вызывает быстрое набухание только в присутствии KCNS. Причина различий состоит в необходимости поддержания баланса зарядов. Вход К+, катализируемый валиномицином, электрогенен, а ацетат проникает через бислой в форме нейтральной протонированной кислоты. Поэтому на мембране быстро возникает большая Дгр (положительный заряд внутри), что предотвращает дальнейший вход К+. Проникновение уксусной кислоты также прекращается, так как перенесенный вместе с ней протон диссоциирует в матриксе и создается градиент рН (кислота в матриксе), который препятствует дальнейшему входу уксусной кислоты (разд. 3.5). Эти проблемы не возникают в случае нигерицина, поскольку вход катиона и аниона оказывается электронейтральным, а протон, перенесенный вместе с уксусной кислотой, выводится ионофором в обмен на К+. По тем же причинам митохондрии набухают в присутствии KCNS и валиномицина, но не KCNS и нигерицина. Таким образом, набухание можно использовать не только для выяснения того, проникает ли данное вещество через мембрану, но и для определения способа переноса. Например, с помощью этой техники было показано, что вход Са2+ в недышащие митохондрии происходит по механизму унипорта (Selwyn et al-, 1970; разд. 8.4).

Транспорт ионов через сопрягающие мембраны

43

А

Валиномицин / Субстрат

КАс / / Валиномицин

К+-

KNOs

Нигерицин

Субстрат

n0,

Рис. 2.8. Сравнение оптимальных условий для набухания и сокращения дышащих митохондрий. А. Оптимальное набухание. Б. Оптимальное сокращение набухших митохондрий.

Для набухания обычно необходимо, чтобы оба иона проникали через мембрану по единому механизму — либо электрогенному, либо электронейтральному. Можно, одн