равило, CPA. Установление С-концевой последовательности фрагментов, полученных в результате гидролиза белка протеиназой из St. aureus, предпочтительнее проводить с помощью CPY.

Пептидгидродазы, отщепляющие N концевые аминокислотные остатки пептидов и белков, составляют группу аминопептидаз. Необходимым условием для действия аминопептидаз является наличие у субстрата свободной а-аминогруппы. Ферменты этой группы гидролизую и дипептиды. В структурных исследованиях белков наибольшее применение нашли леицинаминопептидаза (ЛАП) и амино пептида за М (АПМ), выделяемые из почек свиньи.

ЛАП катализирует отщепление почти всех аминокислот, но с наибольшей скоростью аминокислоты с объемными гидрофобными радикалами (Leu. lie и Val) Пептидные связи, образованные N к нцевыми остатками аргинина и лизина, слабо атакуются ЛАП. а связи ol татка пролина вообще не гидролизуются.

АПМ в одинаковой степени катализирует гидролиз всех пептидных связен, за исключением связей, образованных остатками пролина. Кинетический анализ процесса гидролиза аминопептидазами позволяет определить последовательность 2 5 N-концевых аминокислотных остатков пептида или белка.

Существует группа ферментов, которые при гидролизе пептидов и белков отщепляют N - или С-концевые дипептидные фрагменты. К ним относятся катепсин С, или дипептидиламинопептидаза 1 (ДАП 1), и катепсин В, или дипептидилкарбокс и пептида за Процесс определения аминокислотной последовательности с помощью этих ферментов состоит из нескольких стадий: I) гидролиз исследуемого соединения соответствующей дип птидазои 2) разделение и идентификация отщепленных пептидов, 3) определение порядка расположения дипептидов в полипептидной цепи исследуемой молекулы.

70 Расположение дипептидов в полипептидной цепи определяют либо путем

__ изучения кинетики отщепления дипептидов, либо с помощью так называемого

Белки и Пептиды метода «домино», принцип которого (рис. 23) заключается в том, что гидролиз

с ДАП 1 проводят на исходном и укороченном (с помощью* метода Эдмана) на один аминокислотный остаток пептиде- При этом получают дипептиды с перекрывающимися посзедавательностямн аминокислот.

Один ции

Phe-Glu-Lys Ile-Val Ser-Ala Gly

Рис. 23. Определение аминокислотной последовательности пептидов с помощью дипсптилиламинонептидазы I (принцип

«ДОМИНО»).

Масс-спектрометрический метод. Наряду с химическими и фер ментативными методами для определения аминокислотной последовательности пептидов находят применение физико-химические методы, в частности масс-спектрометрия.

70 эВ

е- -Электронный пучок

Рис. 24. Ионизация молекул электронным ударом.

Процесс съемки масс спектра соединения состоит из нескольких 71

стадий: переведение исследуемого образца в газообразное состоя- -

ние; ионизация его, при которой происходит распад большинства Строение белков и пептидов образующихся молекулярных ионов; ускорение полученных ионов в электрическом поле, последующее их разделение (в зависимости

Хе4 + Хе----—Хе+ + Хе** (ускоренные атомы, 2-S кэВ]

Протежированные

Рис. 25. Ионизация молекул ускоренными атомами Хе (или Аг).

от отношения массы к заряду) в магнитном поле; и наконец регистрация масс-спектра. Вследствие цвиттер-иоиного характера пептиды с большим трудом подвергаются испарению. Летучесть их может быть повышена путем ацилирования и этерификации Для ацилирования обычно используют трифторуксусный ангидрид или N-гид-рокенсукцинимидный эфир жирной кислоты, например декановои Этерификацию можно осуществить метанолом в присутствии каталитических количеств хлористого сульфурила. В ряде случаев прибегают также к переметилированию атомов азота в пептидных связях путем обработки ацилированного пептида йодистым метилом и гидридом натрия в диметилсульфоксиде.

Для ионизации исследуемых молекул в масс-спектрометре используется несколько способов. Традиционным методом ионизации является бомбардировка электронами с энергией порядка 70 эВ (рис. 24). Применяется также ионизация ультрафиолетовыми лучами (фотоионизация) или положительно заряженными ионами (химическая ионизация). В последнее время разработаны новые методы — ионизация в сильных электрических полях (полевая ионизация или полевая десорбция), а также ионизация бомбардировкой ускоренными атомами (атомы Аг и Хе с большой кинетической энергией) (рис. 25). При использовании последних двух методов отпадает необходимость предварительного испарения исследуемого вещества, оно происходит одновременно с ионизацией.

В большинстве случаев в процессе ионизации происходит «выбивание» электронов из молекул испаренного вещества, в результате чего последние превращаются в положительно заряженные ионы. В молекулах пептидов легче всего ионизируются карбонильные

атомы кислорода и атомы азота пептидной связи. При распаде образующихся ионов преимущественно расщепляются связи, находящиеся в положении к положительному заряду. В результате такого распада из молекулярных ионов производных пептидов образуются аминокислотные (А) и альдиминные (а) фрагменты.

R О В2 R1

1\

+

R—СО—NH—СН—С—NH—СН—СО---- —*¦ R—СО—NH—СН—С = О + NH—СН—СО----

(А)

R R2 R1 R2

•+ I I +1-1

R— СО—NH-^CH^CO— NH-CH—СО---- —R—СО—NH—СН + СО —N Н—СН— СО—

(а)

Поскольку в процессе первоначальной ионизации в молекулах исследуемого пептида положительный заряд оказывается локализованным на разных атомах кислорода или азота, при их дальнейшем распаде образуется набор всех возможных фрагментов аминокислотного и альдиминного типа фрагментации (А и а).

RCO — NH-CH-i-CO-HNH—СН-+-СО-"

©

----N Н— СН-4-CO-t- N Н—СН-*- СО-ЮМе

Идентификация пиков аминокислотных и альдиминных фрагментов в масс-спектре дает основную информацию о строении пептида (рис. 26).

Аминокислотный тип фрагментации, конечно, не является единственным путем распада молекулярных ионов пептидов. Боковые цепи каждого аминокислотного остатка вносят свои специфические особенности в общую картину масс-спектра. Ионы фрагментов, образующихся в результате специфического распада боковых цепей, дают дополнительную информацию о структуре пептидов.

Одно из преимуществ масс-спектрометрического метода заключается в возможности анализировать пептиды, не содержащие свободной аминогруппы и устанавливать химическую природу блокирующего остатка. При использовании электронной ионизации метод пригоден для анализа сравнительно коротких (4 — 6 остатков) пептидов. Границы возможностей масс-спектрометрии в изучении структуры пептидов резко расширились с введением более современных методов ионизации. Применив для этой цели бомбардировку ускоренными атомами, Г. Моррис показал, что можно получать масс-спектры пептидов, молекулярная масса которых достигает 3000, причем для определения структуры достаточно 1 — 5 нмоль вещества, т. е, в таком случае по чувствительности масс-спектрометрический метод не уступает другим методам.

Одним из достоинств бомбардировки ускоренными атомами, так же как и полевой десорбции, является исключение стадии предварительной модификации пептида. В настоящее время масс спектрометрия с ионизацией бомбардировкой ускоренными атомами является одним из наиболее прогрессивных методов анализа структуры пептидов средней молекулярной массы (15 — 40 аминокислотных остатков). Особенно эффективно использование метода на завершающих стадиях анализа в сочетании с предварительным исследованием структуры пептида на секвенаторе.

При ионизации полевой десорбцией масс-спектры пептидов состоят практически из одних молекулярных ионов. На этой основе Я. Шимониши был разработан метод исследования структуры белка путем непосредственного анализа смеси пептидов, получаемых после ферментативного гидролиза. Смесь пептидов подвергается деградации по методу Эдмана, и после каждого этапа, наряду с идентификацией отщепленных аминокислот, масс-спектрометри-чески по молекулярным ионам определяются молекулярные массы

73

Строение белков и пептидов

Рис. 26. Принцип масс-спектрометрического метода определения аминокислот ной последовательности пептидов.

Белки и пептиды

Рис. 27. Комбинация метода Эдмана и масс-спектрометрии в анализе структуры белка.

'СОО !ОСЮО

<аххх)

I цинл деградации

ОО

соо M+-Val 1 м Phe

ост' 1 ч

II цикл деградации

=@© оо

з©@ ссо

4.

M^-Ala.Gly

M+-Val.His

M+-Phe,Ala

III цикл деградации

пептидов (рис. 27). Обработка полученных данных на ЭВМ позволяет в большинстве случаев однозначно устанавливать аминокислотную последовательность пептидов гидролизата. Метод особенно эффективен при сравнительном изучении структуры мутант-ных белков.

Хорошие результаты удается также получить при использовании масс-спектрометрии с ионизацией полевой десорбцией или бомбардировкой ускоренными атомами для анализа С-концевой последовательности пептидов в сочетании с ферментативным гидролизом с помощью карбоксипептидаз.

Анализ расположения сульфгидрильных групп и дисульфидных связей

Сульфгидрильные группы остатков цистеина играют важную роль в проявлении функциональной активности многих белков. В условиях, близких к физиологическим, они являются эффективными нуклеофильными реагентами, обладающими высокой реакционной способностью. Поэтому необходимо модифицировать свободные SH-группы белка на первом этапе изучения его структуры.

что обычно достигается с помощью реакции алкилирования 75

(иодуксусной кислотой или ее амидом) или окисления надмуравьи- -

ной кислотой до цистеиновой кислоты. Те же реакции с последую- Строение белков и пептидов щим количественным анализом образующихся произаодных на аминокислотном анализаторе применяются и для предварительного определения числа свободных сульфгидрильных групп. Для этой цели используется также прямое титрование белка реактивом Эллмана [5,5'-дитио-бис-(2-нитробензойная кислота) | или дипи-ридилдису ьфидом приводящее к образованию смешанных сульфидов.

Тнон и тробен зон нл я

При реакции сульфгидрильных групп с реактивом Эллмана образуется тиоиитробензойная кислота, которая обладает сильным поглощением при 412 нм и может быть определена количественно спектрофотометри чески.

Дисульфидные группы цистина менее реакционноспособны, однако они легко в щелочных условиях вступают в реакции дисуль-фидного или тиол-ди сульфидно го обмена:

К —S—S— R + R(—S—S—R'

R —S—S—Rl + R ¦

Молекула белка, стабилизированная дисульфидными связями, устойчива к действию денатурирующих агентов и протеолитиче-ских ферментов. Поэтому при наличии в исследуемом белке ди-сульфидных связей необходимыми этапами работы являются их восстановление и последующая модификация или окисление с образованием стабильных производных цистеина. Число дисульфидных связей в белке определяется по разности суммарного содержания остатков цистеина и количества свободных сульфгидрильных групп.

Дисульфидные группы выполняют важные функции по поддержанию нативной конформации белковой молекулы. Локализация положений дисульфидных связей является обязательным этапом при определении первичной структуры белков.

Последовательность операций на этой стадии следующая: вначале проводится ферментативный гидролиз нативного белка в условиях, исключающих дисульфидный обмен (т. е. при рН ниже 7,0), полученная смесь пептидов фракционируется и у выделенных ци стинсодержащих фрагментов после восстановления дисульфидной саязи определяется аминокислотная последовательность. Разделе-

Иейрат (Neurathl Ганс (р. 1909). американский биохимик. Окончил Венский университет (1933), с 1950 г.— профессор биохимии Вашингтонского университета. Основные работы — по изучению структуры и функции белков, механизма действия протеаз.

76

Белки и пептиды

ние пептидов также необходимо проводить в кислой среде. На практике для выделения цистинсодержащих пептидов часто применяется метод диагонального электрофореза (рис. 28). По этому методу смесь пептидов наносится в центре листа хроматографиче-ской бумаги, проводится электрофорез в буфере с рН 3,6 или 6,5, полученная полоса обрабатывается парами надмуравьиной кислоты для перевода остатков полуцистина в цистеиновую кислоту, и затем повторно проводится электрофорез в тех же условиях, но в перпендикулярном направлении. При проявлении полученной карты нингидриновым реактивом пептиды, содержащие цистеиновую кислоту, обнаруживаются за пределами диагонали.

Стратегия и тактика исследования первичной структуры белков

НСООН + Н2Оа

Рис. 28. выделение цистинсодержащих пептидов методом диагонального электрофореза.

Стратегия изучения первичной структуры белка, особенно на первых этапах, всецело определяется его аминокислотным составом и молекулярной массой. Дальнейший план исследования зависит от полученных результатов и должен подвергаться постоянной коррекции.

Стратегические принципы изучения первичной структуры белка претерпевали значительные изменения по мере развития и усовершенствования применяемых методов. Следует отметить три основных этапа в их развитии. Первый этап начался с классической работы Ф. Сенгера (1953) по установлению аминокислотной последовательности инсулина, второй — с широкого введения в структурный анализ белка автоматического секвенатора (начало 70-х годов) и, наконец, третий — с разработки скоростных методов анализа нуклеотидной последовательности ДНК (А. Максам, В. Гилберт, Ф Сенгер, начало 80-х годов).

В классических работах 60-х — начала 70-х годов для расщепления белка использовались главным образом такие методы, которые позволяли получать большое число фрагментов небольшого размера. Структура их изучалась классическими методами анализа (ручной метод Эдмана, ДНС-Эдман, расщепление карбоксипепти-дазами и аминопептидазамн). При этом для основного гидролиза применялся главным образом трипсин, а для получения перекрывающихся пептидов также использовались ферментативные методы гидролиза (химотрипсин, термолизин и пепсин).

С появлением в лабораториях секвенатора для расщепления белка стали применять химические методы, позволяющие получать крупные фрагменты: расщепление по остаткам метионина — бромцианом, триптофана — В N PS-скатолом, по связи аспарагинил-глицил — гидроксиламином. Из ферментативных методов чаще использовался гидролиз трипсином белка, модифицированного по остаткам лизина, а также гидролиз стафилококковой протеиназой. Такой подход исключал кропотливую работу по выделению и установлению структуры большого числа мелких пептидов, что позволило во многих случаях резко ускорить проведение исследований.

В качестве примера использовании классического подхода при определении Первичной структуры белка может служить установление амишжислотнои после-дпватезьности аспартатаминотрансферазы из сердечной мышцы свиньи (А. Е. Бра-унштейн. В. М. Липкин и др.. IV72).

Аспартатаминотрансфераза относится к числу основных представителей фос-фопиридоксалевых ферментов, катализирующих реакции переаминирования, или трансам и н ирования. На первом этапе определения аминокислотной последовательности этого фермента были использованы исчерпывающий триптический гидролиз карбокс и метилированною образца