Gly-Arg-ne-Ser-Pro-Prie-Ser-Cys-Leu-Lys-Asp-

*40 50 AGA CAT GAC TTT GGA TTC CCC CAG GAG GAG TTT GAT GGC AAC CAG TTC CAG AAG GCT CAA Arg-His-Asp-Phe-Gly-Phe-Pro-Glr-Glu-Glu-Phe-Asp-Gly-Asn-Glr-Phe-Glr-Lys-Ala-Glr-

60 70 GCC АТС Та GTC CTC CAT GAG ATG АТС CAG CAG ACC TTC AAT CTC TTC AGC АСА AAG GAC Ala-lle-Ser-Vel-Leu-Hls-Glu-Met-lle-Gln-Gln-Thr-Phe-Asr-Leu-Phe-Ser-Thr-Lys-Asp-

80 90 TCA TCT GCT ACT TGG GAA CAG AGC CTC СТА GAA AAA TTT TCC ACT GAA CTT AAC CAG CAG Ser-Ser-Ala-Thr-Trp-Glu-Gln-Ser-Leu-Leu-Glu-Lys-Phe-Ser-Thr-Glu-Leu-Asn-Gln-Gln-

* 100 no

CTG AAT GAC CTG GAA GCC TCG GTG ATA CAG GAG GTT GGG GTG GAA GAG ACT CCC CTG ATG Leu-Asr-Asp-Leu-Glu-Ala-Cys-Val-lle-Gln-Glu-Val-Gly-Val-Glu-Glu-Thr-Pro-Leu-Het-

* 120 130

AAT GTG GAC TCC АТС CTG GCT GTG AAG AAA TAC TTC CAA AGA АТС ACT CTT TAT CTG АСА Asn-Val-Asp-Ser-lle-Leu-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Phe-Gln-Arg-Ile-Thr-Leu-Tyr-Leu-Thr-

"j> 150 GAG AAG AAA TAC AGC CCT TGT GCC TGG RAG GTT GTC AGA GCA GAA АТС ATG AGA TCC TTC GlL-Lys-Lys-Tyr-Ser-Pro-C^s-Ala-Trp-Glu-Val-Val-Arg-Ala-Glu-lle-Het-Arg-Ser-Phe-

Pm4j. 127. Аминокислотная последова-

160 166 тельность а-интерферона человека и ну к

ТСТ ТТА TCA AAA ATT TTT CAA GAA AGA ТТА AGG AGG AAG GAA TAA ACTC леотидная последовательность соответ-

Ser-Leu-Ser-Lys-Ile-Phe-Gln-Glu-Arg-Leu-Arg-Arg-Lys-Glu-Tyr ствующего гена.

ной последовательности, на начальном этапе синтезируется предшественник интерферона, содержащий сигнальный пептид из 23 аминокислотных остатков; последний отщепляется в результате процессинга при секреции белка. 0- и у-Интерфероны также синтезируются в виде предшественников (у человека р интерферон содержит 166 аминокислотных остатков, а у-интеРФеРон — '43 остатка ).

ее- и [i-Интерфероны представляют собой типичные глобулярные белки (содержание а-спиральных структур составляет 40—75%). В а интерферонах обнаружены дае дисульфидные связи.

Механизм биологического действия интерферона в общих чертах выяснен. Интерфероны синтезируются н секретируются одними клетками и проявляют свой эффект, воздействуя на другие клетки, в этом отношении они подобны гормонам. Обшая схема биологического действия интерферона представлена на рисунке 128.

Связываясь с клеточными рецепторами, интерфероны индуцируют синтез двух ферментов — 2',5'-олигоаденилатсинтетазы и протеинкиназы, вероятно, за счет инициации транскрипции соответствующих генов. Оба образующихся фермента проявляют свою активность в присутствии двухцепочечных РНК, а именно такие РНК являются продуктами репликации многих вирусов или содержатся в их вирионах. Первый фермент синтезирует 2',5'-олйго-аденилаты (из АТР), которые активируют клеточную рибонук-леазу 1; второй фермент фосфорилирует фактор инициации трансляции 1F2. Конечным результатом этих процессов является ингибирование биосинтеза белка и размножения вируса в инфицированной клетке, а затем ее лизис. Доказано, что существуют и альтернативные механизмы действия интерферонов (инактивация тРНК, вмешательство в процессы метилирования и т. п.).

Интерфероны — мощные противовирусные агенты. Они во все возрастающем масштабе используются в медицинской практике для лечения вирусных заболеваний, таких, как гепатит, энцефалит, бешенство, герпес и т. п. Имеются достаточно обоснованные данные об эффективности ряда интерферонов против некоторых форм рака. Интерфероны действуют в весьма небольших дозах при местном или внутримышечном применении; при этом в ряде случаев у пациентов отмечается некоторое повышение температуры. В мировой практике в настоящее время накапливается все больший опыт использования интерферонов при самых различных заболеваниях, втом числе при эпидемиях гриппа, аденовирусных инфекциях и т. п. Примечательно, что описаны случаи эффективно о использования интерферонов для борьбы с вирусами не только сельскохозяйственных животных, но и многих культурных растений.

Широкому применению интерферонов в медицинской практике долгое время препятствовало отсутствие экономичных методов их получения. Первоначально наибольшее распространение получил метод производства лейкоцитарного интерферона на основе донорской крови (К. Кантелл, Финляндия, 1977). При этом лейкоциты подвергаются инкубации с каким-либо вирусом (например, вирус Сен дай нли вирус болезни Ньюкасла), в качестве компонента культуральной среды используется сыворотка крови человека илн быка (иногда казеин молока). Последующая очистка с помощью хрома то графических приемов дает достаточно концентрированный препарат интерферона.

Радикальным решением вопроса оказалось использование методов генетической инженерии. В частности, гены интерферона удалось экспрессировать в различных клетках, в том числе бактериальных, дрожжевых и клетках млекопитающих (см. с. 378).

Лимфокины и монокины. В процессе развития защитной реакции организма активированные лимфоциты секретируют набор бел-

Мембранный рецептор

j Мессенджер

ЭО00СООС

Клеточный геном

Индукция синтеза ферментов

,5 -Олигоаденилат-синтетаза

Протеин-ниназа

-ххххххххххххх-

Двух цепочечная РНК

АТР —рррА(2'-5)р[А(2-5)рА]п12-»5)рА eIF-2—p-eIF-2

\ АТР t

Антивация РНКазы I, Ингибирование

деградация иРНК и —— синтеза белна рибосомной РНК

227

Биологическая роль белков

Рис. 128 Механизм действии интерферона.

228 ков, регулирующих пролиферацию и дифференцировку клеток им-

- мунной системы; для таких белков часто используется термин

Белки и пептиды интерлейкин.

Открытый в 1976 г. в лаборатории Р. Галло (США) интерлейкин 2 (1L2, ранее называвшийся клеточным ростовым фактором) вызывает пролиферацию активированных Т-лимфоцитов и занимает центральное место в каскаде интерлейкиноа (или лимфокинов); он продуцируется зрелыми Т-лимсроцитами (Т-хелперами) в результате их стимуляции антигенами.

В индивидуальном состоянии интерлейкин 2 человека удалось получить на основе использования метода хроматографии высокого давления на обращенной фазе и применения мо но клона ль ных антител. Он представляет собой сравнительно небольшой гицро-фобный белок, содержащий 133 аминокислотных остатка (рис. 129). Рис. 129. Аминокислотная последова- Аминокислотная последовательность интерлейкина 2 человека опре-

тельность интерлейки на 2 человека делена по структуре соответствующего гена (Т. Танигучи, 1983)

сно

'А1аУ~\ 1

и затем подтверждена анализом самого белка. К одному из амино- 229

кислотных остатков (TTir-З) интерлейкина 2 присоединена углевод- -

ная цепь (за счет О гликозиднои связи), в состав которой входят Биологическая роль белков остатки N ацетил не ира ми новой (сиаловой) кислоты (NeuNAc), галактозы (Gal) и N ацетилгалактозамина (GalNAc). Характерно, что наличие углеводов не влияет на биологическое действие интерлейкина 2: рекомбинантный 1L 2 имеет ту же удельную актианость, что и природный.

Попытки выделить небольшой пептид, моделирующий активный центр молекулы, не увенчались успехом. Использование метода направленного точечного мутагенеза и моноклональных антител к определенным участкам молекулы 1L2 показало, что активный центр формируется аминокислотными остатками, находящимися на N и С-концах молекулы, сближенных в пространственной структуре молекулы за счет дисульфид ной связи.

По характеру биологического действия интерлейкин 2 напоминает гормоны: он продуцируется клетками в весьма малых количествах, активен в концентрациях порядка нескольких пикомолей (на 1 мл), действует на клетку-мишень через соответствующий рецептор на ее поверхности (Kj = 3 — 5x10 |2М). «Период полу-жизнн» интерлейкина 2 в кровотоке измеряется минутами.

Интерлейкин 2, получаемый в настоящее время в промышленном масштабе иа основе методов генетической инженерии (СССР, США), используется при лечении вирусных заболеваний, иммуно-дефнцитов, некоторых форм рака.

Интерлейкин 1 (1L1, или лимфоцитактивирующий фактор), впервые описанный И. Джери и Б. Ваксманом (США), продуцируется активированными макрофагами, а также полиморфноядерными лейкоцитами, эпителиальными клетками кожи и другими клетками. Он инициирует пролиферацию фибробластов, синтез простагландинов; основной же мишенью являются активированные Т-хелперы, которые в присутствии 1L 1 секретируют IL2.

Интерлейкины 1 человека представляют собой белки, состоящие из 159 (1L 1«) и 153 (1L 1р) аминокислотных остатков. В ходе биосинтеза они получаются из высокомолекулярных белков-предшественников (271 и 269 аминокислотных остатков соответственно).

В отлнчие от интер еикинов 2 и 1, открытый Д. Иле с соавторами (США) интерлейкин 3 (из мыши, IL3) действует не на зрелые клетки иммунной системы, а на клетки-предшественники: он вызывает рост колоний стволовых клеток и предшественников В клеток Источником интерлейкина 3 являются активированные Т-хелперы. По харвктеру своей активности 1L 3 принадлежит к факторам, стимулирующим рост колоний различных клеток (CSF); он действует в концентрациях 10 11 — 10 '"М. Интерлейкин 3 является гликопротеином, в состав которого входят 134 аминокислотных остатка.

К группе белков, продуцируемых активированными клетками иммунной системы и родственных интерлейкинам, следует отнести лимфотоксин и фактор некроза опухолей.

Лимфотоксин (LT) был впервые описан в конце 60-х годов как продукт активированных лимфоцитов, обладающий цитостатиче ской активностью. Действие лимфотоксина на опухолевые клетки заметно усиливается в присутствии у интерферона Лимфотоксин человека является гликопротеином (171 аминокислотный остаток); углеводная цепь связана N гликозиднои связью с Asn 62 (рис. 130).

Фактор некроза опухолей (TNF). TNF вызывает лизис некоторых типов опухолевых клеток. Он вырабатывается активированными макрофагами. Строение TNF человека, проявляющего заметную гомологию с лимфотоксинами, установлено на основе ана-

230 лиза нуклеотидной последовательности соответствующего гена.

—-—¦- Пептидная цепь его состоит из 157 аминокислотных остатков

Белки и пептиды и синтезируется в виде предшественника (233 остатка). Оба цито-

токсическнх фактора реагируют с одним и тем же рецептором

поверхности опухолевой клетки.

Рис. 130. Аминокислотная последовательность прелимфотоксина и нуклео-тндная последовательность соответствующего гена.

¦,GG LCi CAG JC П GGI С '* '/Л ft AJ.A ССТ TCA СП ССС CAG AC UC CGT CAG CAC CCC AAG AIG CAT

Ц1у Ala Gin »*y Leu Pro Gly to) Ц/ Leu Thr Pro Ser Ala Ala Gin ГПг Ala Arg Gin Ms Pro Lys Met His

AAC Aj

Kit TAT TTC GTC TAC ICC CAG СТГ, eTC 1tc TfT njG AAA GCC TAC TCT CCC AAG GCC ACC TCC ICC CCA CTC TAC Mr Туг Phe V*l ^vr Ut G'4 \*\ Va> Phe *r uy iys Ala Туг S«- Pro Ljs Aid Tr- Ser Ser Pra Leu Tyr

10D 110 3

(4 t.C CAT GAG »" CAG CTC TT( ' TCC CAG TAC Ci I T¦ ¦ CAT GTh T CTC CTC AGC TCC CAG AAG ATG GTC L*j Ala His Glu Val | Leu Phe '- . . n Tyr Pro Pne His Val Pro Leu Leu Ser Ser Gin Lys Het Val

Лимфотоксин и фактор некроза опухолей рассматриваются как весьма перспективные противораковые препараты и в настоящее время производятся и испытываются биотехнологическнми фирмами и центрами в ряде стран мира.

Белки систем свертывания крови и фибринолиза

Хорошо известно, что при порезе или ранении выходящая из раны кровь быстро загустевает, свертывается, предохраняя таким образом организм от потери крови. Механизм свертывания крови в настоящее время достаточно хорошо изучен, главную роль в его реализации играют многочисленные белки.

В 1863 г. английский хирург Д. Листер (1827—1912) обратил внимание на интересный факт — на бойне кровь долгое время остается жидкой в иссеченных венах бычьих туш, но быстро свертывается, если ее перенести в стеклянный сосуд. Отсюда был сделан вывод, что свертывание крови вызывается находящимися в ней факторами, которые активируются на стеклянной поверхности В то же время давно установлено, что свертывание можно инициировать повреждением сосудов или добавлением в кровь каких-то

посторонних веществ, например экстрактов некоторых тканей. На 231 этом основании принято различать внутренний (собственный) " и внешний пути свертывания крови. При обычном свертывании Биологическая роль белков крови внутренний и внешний пути действуют в им в занно

Э. Дэви установил первичную структуру ряда факторов свертывания крови и внес значительный вклад в расшифровку молекулярных механизмов процесса свертывания крови.

С биохимической точки зрения свертывание крови и образование сгустка представляют собой каскад ферментативных реакций, осуществляемых группой специальных белков (белковых факторов). В цепи последовательных превращений каждый образовавшийся фактор вызывает активацию следующего по принципу профермент—»- фермент, так что небольшие количества того или иного фактора на начальных этапах процесса вызывают лавинообразное усиление на последующих стадиях и, как результат, быструю ответную реакцию на травму. Внутренний и внешний пути свертывания различаются лишь иачвльными стадиями, а затем они сливаются в единый, общий путь свертывания (рис. 131) (Р. Макфер-лан, 1965—1966). Внутренний путь свертывания крови реализуется при адсорбции фермента калликреина и высокомолекулярного кининогена на поврежденной поверхности эндотелия сосудов или на какой-либо инородной поверхности (стекло, керамика и др.). При запуске внутреннего пути фактор XII (известный также под иазввнием фактора Хагемана) расщепляется калликреино Это расщепление осуществляется двумя путями — с образованием фак-

232

Белки и пептиды

Дии |Davie| Эрл В. (р. 1927), американский биохимик Образование полу чил в Вашингтонском университете (1954) в настоящее время работает в университете Вашингтона в Сиэттле. Основные работы в области химии белка, энзимологии и рекомбинант-ны> ДНК. Изучал молекулярные механизмы свертывания крови. Выделил и охарактеризовал ряд генов белков, участвующих в процессах свертывания и фибринолиза крови.

тора XI 1а, т. е. активированного фактора XII, или с образованием фрагмента, имеющего молекулярную массу 28 ООО, который, а свою очередь, активирует превращение прекалликреина в калликреин.

Активированный фактор ХНа вместе с калликреином и кииином (последний образуется из высокомолекулярного кининогена при действии калликреина) превращает затем фактор XI (предшественник плазменного тромбоп ласти на) в активную форму Х1а (плазменный тромбопластин), последний активирует фактор IX (Кристмас-фактор). Кристмас фактор получил свое название по имени Стерена Кристмаса — мальчика с нарушениями в системе свертывания крови; из его крови впервые был выделен этот новый белок. Наконец, активированный фактор 1Ха вместе с еще одним белком — фактором V1U вызывают активацию фактора X (Стюарт-фактор) с образованием фактора Ха и включают, таким образом, общий путь свертывания. ¦

Фактор VIII, называемый аптигемофильным фактором, является белком-модификатором. Отсутствие его в крови (например, в силу генетического дефекта) вызывает тяжелейшее заболевание — гемофилию. При гемофилии нарушение свертывающей способности крови может передаваться по наследству. В частности, широко известен такой исторический факт: английская королева Виктория,

®