НК подвергается кратковременной обработке мурааьиной кислотой, в результате которой часть пуриновых оснований удаляется, и поли-нуклеотидная цепь затем расщепляется по образующимся дезокси-рибозным остаткам под действием пиперидина. Из модельного олигонуклеотида при этом должны образоваться следующие меченые соединения:

l2P. d (32pG-T-C-Tp), d (32pG-T-C-T-A-Cp), d(32PG-T-C-T-A-C-Gp), d(32PG-T-C-T-A-C-G-G-C-Cp), d ("pG-T-C-T-A-C-G-G-C-C-A-Tp)

Рис. 181. Химическая модификация по I нози новым звеньям.

о

R-O—f—О—СН. | NH,__R~0—Р—О— СН,ПН ©,- р-Элимини_

v cv

О" о ~ R' О О ~ R

R~0—Р—О— СН2_„ ©/-Ч он . R-О—Р—О—СН^-С(ОН)—СН=СН—CH=hl )

' II Т

5-R-0—Р—О + СН2=С—СН=СН—CH=N j

-о /> о + р

/ \ , II т ®/—\

О" 0~R'3- CHj—С—СН=СН—CH=N )

Рис. 182. Химическая м дифнкация по цитозин вым звеньям

В. Расщепление по цитозииу осуществляется гидразином при 325

высокой концентрации NaCl с последующей обработкой продуктов -—

модификации пиперидином (рис. 182). что приводит к образованию Строение нуклеиновых кислот следующих олиго нуклеотидов:

d(32pG-Тр). d(,2pG -Т-С -Т- Ар). d(J2pG- T- C-T-A-C-G- Gp),

d(3'pG-T—C-T-A-C-G-G-Cp). dt"pG-T—C-T-A— C-G—G-C—C-A- T-Ap), d(32pG-T-C-T-A-C-G-G-C-C-A-T-A-Cp)

Г. Для определения положения тимидина используется деградация по остаткам пиримидинов, для чего ДНК последовательно обрабатывается гидразином при низкой концентрации NaCl, а затем пиперидином. Из модельного олигонуклеотида при этом, кроме соединений, приведенных выше, должны образоваться:

d("pGp), d("pG-T-Cp) и drpG-T-C-T-A-C-G-G-C _С- Ар)

Продукты всех четырех реакций наносят в соседние лунки по-лиакриламидного геля, разделяют электрофорезом и радиоавто-графируют. Анализ результатов, схематически представленных на рисунке 183, приводит к следующим выводам: самый «короткий» фрагмент (сросфат) находится в колонках С и А + G и, вероятно, образовался в результате расщепления по гуаиозину; наличие полосы в колонке Т 4- С и ее отсутствие в колонке С свидетельствует о том, что это продукт расщепления по тимидину, следом идет олигонуклеотид, присутствующий и в колонке С, и в колонке Т + С, т. е. получившийся в результате расщепления по цитозину. Затем по подвижности располагаются продукты в колонке Т -f- С (но не вС), А + с (но не в G); продолжая этот анализ, восстанавливаем структуру исходного олигонуклеотида.

В приложении к реальным полинуклеотндам метод дает возможность «прочесть» последовательность свыше 200 нуклеотидных звеньев на одном геле.

Проблемой, которую каждый раз приходится решать при использовании метода Максама — Гилберта, является получение поли-нуклеотидов, меченных только по одному из концов. Обычно для анализа используются двух цепочечные фрагменты ДНК (например, образовавшиеся после расщепления рестриктазами), а все методы введения концевых меток приводят к образованию фрагментоа, меченных по двум 5'- или двум З'-концам. Поэтому приходится прибегать к дополнительным операциям, таким, как разделение комплементарных цепей ДНК после введения метки.

Метод ДНК-полимеразного копирования в присутствии терминирующих аналогов три фосфатов (метод Сенгера). Этим методом чаще всего анализируются фрагменты ДНК, клонированные в одноцепочечных фагах, хотя в настоящее время разработаны варианты, применимые и к двухцепочечным ДНК. При этом исследуется не сам фрагмент, а комплементарная ему ДНК, которая синтезируется с помощью ДНК-полимеразы в условиях, приводящих к набору Продуктов разной длины, содержащих одинаковый 5'-концевой участок, а на

Ра ще ппение по гуанозиновым звеньям

Расщепление пи пуриновым звеньям

C,H„N

Расщепление по пиримидиновым звеньям

NH.- NHa NaCl C0H„N

Расщепление го цигозиноным звеньям

NH..-NHj

Hac.NaCl, CbHltN

pG ТС TAC G G-C-C A T A-C-C

Продукты расщепления no G

t p GTCTACp) d(J'pGTCTACGp)

d( 'pGTCTp) dr'pGTCTACp) dC,?pGTCTACGp) dl1 pGTCTACGGCCp) d(u pGTCTACG GCCATp)

Продукгы расщеппения по С

d( "pGp) d( pGTp) df pGTCpJ d( pGTCTAp) d( pGTCTACGGpl d( pGTCTACGGCp) d(' pGTCTACGGCCApJ d( pGTCTACGGCCATAp) dt'pGTCTACGGCCATACp)

Электрофорез н полианриламидном геле и радиоавтография

— G A G Т+С С

—

--

-- --

--

Д 'cGTp) d 'pGTCTAp) dl 'oGTCTACGGp) d(5 pGTCTACGGCp) dl''pGTCTACGGCCATAp) d( pGTCTACGGCCATACp)

Рис. 183. Схема определения нуклеотиднои последовательности (метод Мак сама — Гилберта).

З'-конце — звенья определенного типа (A, G, С или Т). Для получения такого набора фрагментов к смеси четырех природных дезокси-рибонуклеозидтрифосфатов, используемых ДНК-полимеразой для синтеза копии, добавляют трифосфат аналога того нуклеозида, который желательно иметь в качестве З'-концевого звеиа. Этот аналог отличается от соответствующего природного субстрата лишь строением углеводного компонента, что позволяет ДНК-полимеразе включать его в цепь, но ие дает возможности присоединять последующие звенья. Чаще всего в качестве таких терминирующих аналогов используют трифосцЬаты 2', З'-дидезокс и нуклеозидов. Так, для получения набора фрагментов, оканчивающихся тимидином, в смесь для полимеризации добавляют 2',3'-дидезокситимидинтрифосфат; для обрыва по аденозину — З'.З'-дидеэоксиаденозинтрифосфат и т. д. При введении в реакцию любого аналога ДНК-полимераза с определенной вероятностью включает его в цепь вместо природного субстрата, после чего синтез цепи обрывается. Включение аналога происходит по закону случая в любом месте синтезируемых цепей; в итоге получаются наборы олиго- и поли нуклеотидов различной длины, но с одинаковыми звеньями на З'-концах, как это показано на рисунке 184.

Для получения продуктов с уникальным 5'-концом синтез ДНК начинают с помощью затравки — олиго- или полинуклеотида, комплементарного матрице на участке, расположенном рядом с З'-концевой областью матрицы. Затравка содержит свободную З'-ОН-группу, необходимую ДНК-полимеразе для начала синтеза ДНК. Гибридизуясь с матрицей в определенном месте и включаясь во вновь синтезируемую ДНК в качестве ее 5'-концевого участка.

327

Строение нуклеиновых кислот

он

шяяшшшт ddT ДНК- полимерам 1 dATP. ОСТР. (JGTP.

ddT

Гилберт (Gilbert) Уолтер (p. 1932), американский биохимик. Окончил Гарвардский университет (1953); с 1968 г.— профессор этого университета, затем президент фирмы «Биоген». Выполнил основополагающие исследования по изучению механизма специфического взаимодействия белков и ДНК, установлению первичной структуры ДНК, предложил (1977, совместно с А. Мак самом) метод расшифровки первичной структуры ДНК. Лауреат Нобелевской премии по химии (1980, совместно с Ф. Сенгером и П. Бергом).

Рис. 184. Пример специфического обрыва синтезируемой полинуклеотидной цепи в присутствии терминирующего аналога ie ижеитимидинтрифосфата.

328 затравка обеспечивает уникальность этого эвена для всех наборов - специфически оборванных копий.

Нуклеиновые кислоты ДдЯ того чтобы синтезируемые продукты были радиоактивными,

в качестве одного нз четырех природных дезоксирибонуклеоэид-трифосфатов используется [ссЭ2Р] -меченый продукт. С этой целью смесь затравки и матрицы разделяется на четыре части: с одной проводится синтез в присутствии ddTTP с образованием фрагментов, терминируемых тимидином, с другой — в присутствии ddATP, с третьей — в присутствии ddCTP и с последней — в присутствии ddCTP. Все четыре радиоактивных набора продуктов наносятся на параллельные дорожки полнакриламидного геля, разделяются, радиоавтографируются и анализируются так же, как в методе Мук сама — Гилберта.

Как уже упоминалось, чаще всего в качестве матрицы для анализа используются фрагменты ДНК, клонированные в одноцепочечных фагах. Для унификации анализа последовательности любых фрагментов, клонированных в составе данного фага-вектора, можно использовать одну и ту же затравку. Для этого затравка должна быть комплементврна ие клонированному фрагменту, а <-|-)-цепи фага вектора в том ее месте, которое граничит с З'-концом клонированной вставки (рис. 185). В качестве затравок чаще всего используются синтетические олиго- и дезокси рибо нуклеотиды. Для исключения деградации затравки с 5'-конца в качестве ДНК-полимеразы применяется обычно «фрагмент Кленова» ДНК-полимеразы I Е. coli.

Метод Сенгера наиболее часто используется для анализа последовательности ДНК после ее неспецифического расщепления и клонирования суммы получаемых фрагментов. Метод весьма эффективен и экономичен, так же как метод Максама — Гилберта, и позволяет анализировать последовательность свыше 200 звеньев на одном геле.

Методы быстрого определения последовательности РНК. Эти методы могут быть разбиты на две группы — прямые, когда анализу подвергается непосредственно РНК, и косвенные, когда анализируется, например, кДНК, полученная путем копирования РНК с помощью обратной транскрип-тазы и клонированная в составе какого-либо вектора, или соответствующий ген, кодирующий данную РНК после выделения его из библиотеки генов. Косвенные методы, естественно, являются методами анализа последовательности ДНК; прямые же методы анализа РНК аналогичны используемым в случае дезоксирибонуклеотидов. Так же как и для ДНК, может быть применен метод копирования с терминирующими аналогами трифосфатов, но вместо ДНК-полимеразы используют обратную транскриптазу, а в качестве затравки — синтетические олигонуклеотиды или рестриктив-ные фрагменты, комплементарные данной РНК.

Существуют химические методы частичных расщеплений Замеченных РНК, аналогичные применяемым для ДНК. Различие заклю-

Рис. 185. Иллюстрация использования иддчон и той же затраакм с данным вектором для анализа последовательности различных фрагментов.

чается в том, что при расщеплении модифицированной РНК по образующимся рибозильным звеньям или их производным нельзя использовать щелочные условия, поскольку происходит неспецифический гидролиз РНК. Поэтому расщепление проводят в слабокислой среде в присутствии аминов. Для модификации применяют диметилсульфат (G), гидразин + NaCl (С), гидразиигидрат (U) и диэтилпирокарбонат, который модифицирует А и С, ио преимущественно А. Однако наиболее широко распространены методы неполных расщеплений РНК специфическими рибоиуклеазами. Как и в случае метода Максама — Гилберта, РНК маркируют с помощью полинуклеотидкиназы для 5'-конца или РНК-лигазы для З'-конца. Затем меченую РНК разделяют на несколько порций и каждую порцию подвергают неполному расщеплению одной из специфи ческих РНаз. Продукты, полученные из каждой порции, наносят в соседние лунки плоского поли акрила мил но го геля, разделяют и радиоавтографируют. Недостатком метода является малая специфичность РНаз к данному типу оснований, а также зависимость скорости расщепления от типа основания. Вследствие этого приходится использовать набор различных РНаз с перекрывающейся специфичностью.

Некоторые из применямых для частичных расщеплений РНаз приведены в таблице 13.

Быстрые методы определения последовательности не решают всех задач, стоящих перед исследователем первичной структуры нуклеиновых кислот, поскольку они не дают информации о Моложе нии и природе минорных компонентов нуклеиновых кислот. Такие задачи встречаются при изучении структуры тРНК. В этих случаях сохраняют свое значение «старые» методы определения последовательности, заключающиеся в исчерпывающем или частичном гидролизе рибоиуклеазами, выделении индивидуальных олнгоиук-леотидов, определении их нуклеотидного состава и идентификации минорных компонентов

Таблица 13.

Рибонуклеазы, используемые для анализа последовательности РНК

РНаза Специфичность Првменение

Т2 Неспецйфична Для получения статистического набора олигонуклестидов всех возможных длин

Т1 G Для анализа распределения гуаниловых остатков

U2 A> G Для определения положения А остатков (разработаны условия расщепления исключительно по связям AplN1)

А U+G» Для анализа последовательности используется редко ввиду резкого различия в скоростях расщепления связей <РутРи>Ру|ру>

Вс U + C Для определения положения пиримиди-

(пиримидин РНаза новых звеньев

из Bacillus cereus)

PhyM A+U Широко используется как РНаза с пере-

(из Physarum poli- крывающейся пецнфичиостью для про-

cephalum) верки расщеплений по А и для отличия U от С

1 РНазы, выпускаемые некоторыми фирмами специально для анализа последовательности нуклеотидов в РНК (sequence grade), в определенных условиях проявляют исключительно высокую специфичность по отношению к основаниям.

329

Строение нуклеиновых кислот

330

Нуклеиновые кислоты

Баев Александр Александрович

(р. 1904), советский биохимик, академик АН СССР (1970). Окончил Казанский университет (1927), с 1959 г.— заведующий лабораторией функциональной энзимологии Института молекулярной биологии АН СССР и отделом молекулярной биологии и молекулярной генетики микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР. Основное направление исследований — строение нуклеиновым кислот и генная инженерия. Установил (1967) первичную структуру валиновой тРНК дрожжей. Разработал метод изучения функциональной топологии биополимеров (метод разрезанных молекул). Герой Социалистического Труда (1981), лауреат Государственной премии СССР (1969).

Для иллюстрации применяемых здесь методов и приемов рассмотрим определение структуры одного из гексануклеотидоа, полученных при исчерпывающем гидролизе вали но во и тРНК РНазой TI (А. А. Баев и сотр.).

A. Определение нуклеотидного состава, проведенное после щелочного гидролиза, дало результат:

Ар + Up + ЧФ + 2Ср + Gp

Б. Из способа получения (гидролиз гуанилрибонуклеазой) было ясно, что Gp должно находиться на З'-конце.

B. Исчерпывающий гидролиз фо чЬодиэстеразой змеиного яда дал единственный нуклеозид — цитидин. Отсюда следует, что олигонуклеотид содержит на 5'-конце цитидин и, таким образом, его структура C(A,U,i|"-,C)Gp.

Г. Полный гидролиз пИримидил-РНазой привел к следующим продуктам: 2Ср -f- Арт)р + Up -f- Gp и, значит, его структура C(A,4,U,C)Gp.

Д. При частичном гидролизе пиримидил-РНазой был выделен пента нуклеотид С<и,ч',А,С). ДечЬосфорилирование и последующий исчерпывающий гидролиз последнего панкреатической РНазой обнаруживают среди нуклеотидов один нуклеозид — уридин, который, следовательно, находится на З'-конце пентануклеотида. Следовательно, остаются возможными только две структуры гекса-нуклеотида: С — А — ф — С — U — Gp или С — С — А — Ф — U — Gp. Выбор между ними был сделан на том основании, что среди продуктов частичного гидролиза гексануклеотида панкреатической РНазой был обнаружен дииуклеотид CpUp, а это возможно лишь в том случае, если верна первая из двух структур.

В заключение раздела, посвященного анализу последовательности нуклеиновы