р _ Мил - (1 —4) - Р - GlcNAcо - NeuAc - (2-^) - р - G«1 - (1 —4) - р - GlcNAc - (1 —2) - а
Men
Р - GkNAc-(l — N)-A«n
а - NeuAc - (2-»*) - Р - Gal - (1 ~4) - р - GlcNAc
Олигосахариды гидролизуются кислотами до моносахаридов по механизму, 463
аналогичному механизму гидролиза О-глико ждов: реакция протекает через обра---- -
зование гли ко зил-катиона. Восстанавливающие олигосахариды дают реакции, харак- Строение УГЛеВОЯОВ
терные для карбонилсодержащих соединений, окисляются до альдоновых кислот,
восстанавливаются до полиолов, образуют озазоны. Как и в случае моносахаридов, и Углеводсодержащих
в водных растворах восстанавливающих олигосахаридов наблюдается мутаротация. биополимеров
Для i идроксильных и дру| их функциональных групп олигосахаридов характерны те же реакции, что и для составляющих их моносахаридов
Разделение смесей олигосахаридов проводится сочетанием хрома то графи ческих методов. Кислые олигосахариды отделяются от нейтральных ионообменной хроматографией или электрофорезом на бумаге. Разделение нейтральных олигосахаридов осуществляется с помощью хроматографии на бумаге и тонкослойной хроматографии на силикагеле. В последнее время для разделения олигосахаридов все чаще используется ВЭЖХ
В отличие от химии белков и нуклеиновых кислот, где определение первичной структуры сводится к установлению последовательности аминокислот или нуклеиновых оснований в линейной цепи биополимера, в случае углеводных биополимеров задача существенно усложняется. Для выяснения строения олигосахарида необходимо определить его моносахаридный состав, последовательность моносахаридных остатков и места разветвления олигосаха-риднои цепи, места присоединения моносахаридных остатков друг к другу, размеры циклов моносахаридных звеньев, конфигурацию гликозидных связей.
Определение моносахаридного состава проводится анализом продуктов кислотного гидролиза или. чаще, мета-нолиза сахарида. Состав продуктов кислотного гидролизата анализируется с помощью хроматографии или электрофореза на бумаге. Нередко используется коммерческий углеводный анализатор, разделение осуществляется на ионообменных смолах методом распределительной хроматографии в водно-спиртовой смеси или в виде боратных комплексов Сахаров. Скорость гидролиза гликозидных связей, образованных остатками нейтральных, амино- и дезокси-сахаров, различна. Легче всего отщепляются остатки сиаловых (N аце илнеираминовои N-гликолилнейраминовой) кислот, труднее всего расщепляются связи, образованные остатками амино Сахаров и уроновых кислот. Фуранозиды гидролизуются значительно быстрее пиранозидов. В итоге при гидролизе олигосахарида может иметь место неполное расщепление связей или кислотная деструкция образующихся моносахаридов, что искажает результаты анализа. Лучшие результаты дает метанолиз в присутствии газообразного хлористого водорода (1,7 н. НО. 80 С, 18 ч) — в этом случае образуются метилгликозиды, устойчивые к кислотной деструкции. Качественный и количественный состав продуктов метанолиза определяется методом газожидкостной хроматографии в виде триметилсилильных или трифтораце ильных производных.
Определение мест присоединения моносахаридных остатков друг к другу осуществляется исчерпывающим метилированием олигосахарида с последующим гидролизом и анализом образующихся продуктов. Метилирование в большинстве случаев проводится по методу С.-И. Хакомори (см. с. 468), при этом наряду с гидроксильными группами модификации подвергается также ацетамидная группа N-ацетилгексоза-минов. Полнота реакции контролируется И К спектроскопией по отсутствию полосы поглощения гидроксильных групп.
Олигосахарид подвергается далее кислотному гидролизу или, лучше, метанолизу, в результате получается набор метилированных моносахаридов со свободными гидроксильными группами, участвующими в образовании гликозидных связей.
По результатам анализа можно судить также о структуре оли госа хари дно го остова: обнаружение в метилированных продуктах после метанолиза моносахаридов с более чем одной свободной гидроксильной группой свидетельствует о наличии в цепи разветвлений. Одновременно этим путем можно определять концевые моносахаридные остатки. Остаток, локализованный на невосстанав-ливакэшем конце олигосахаридной цепи, не содержит свободных гидроксильных групп, а моносахарид, находившийся на восстанавливающем конце, легко идентифицировать в виде метилироаанного полиола в продуктах гидролиза метилированного восстановленного олигосахарида. Таким образом, для трисахаридов анализ метилированием сразу дает последовательность моиосахаридных звеньев в молекуле.
СН2ОН
11. МвН.ДМСО
12. Ме[
СНаОМе СН2ОМе ^sCH?
Meoj-—О ^-°Ме
ОМе OMe СН.С
Г
Идентификация продуктов проводится методом 1ЖХ путем сравнения со стандартными, частично метилированными метилгли-козидами. Широкое применение иашел хромато-масс-спектрометрический метод анализа альдитацетатов, получающихся после восстановления боргидридом и ацетилироаания продуктов гидролиза.
Кроме того, используется (О. С. Чижов и др.) масс-спектрометрический метод установления строения метилированных метил
г
гликозидов. подвергнутых после гидролиза исчерпывающему 465 дейтеро метилированию. Расшифровка масс-спектров позволяет
однозначно установить положение дейтерометильных групп, отве- Строение углеводов
чающее локализации свободных гидроксильных групп в исходном и углеводсодержащих
частично метилированном метил гли ко зиде. * биополимеров
Последовательность звеньев в молекуле гетерооли госахарида определяется главным образом с помощью экзогликозидаз — ферментов, отщепляющих по одному моносахарид ному остатку с невосстанавливающего конца молекулы. В таблице 16 приведены данные о специфичности и источниках ферментов, часто используемых для анализа структуры олигосахаридов, входящих в состав животных гликопротеинов.
Гликозидазное расщепление целесообразно проводить в сочетании с методом метилирования; с помощью метилирования определяется концевой невосстанавливающнй моносахаридный остаток, далее он отщепляется соответствующей гликозидазой, а затем вновь образовавшийся невосстанавливающнй концевой моносахарид идентифицируется с помощью метилирования.
Важным свойством гликозидаз является стереоспецифичность их действия: а ликозидаза не расщепляет р-гликозидную связь. . Это свойство позволяет однозначно установить конфигурацию гликозидной связи расщепляемого олигосахарида.
К классическим методам структурного анализа углеводсодержащих биополимеров относится периодатное окисление (см. с. 468).
Модификацией метода является деградация по Ф. Смиту, заключающаяся в последовательном окислении сахарида периодатом, восстановлении боргидридом и последующем мягком кислотном гидролизе образующегося продукта; сохранившиеся гликозидные саязи при этом не затрагиваются.
466
Таблица 16.
Углеводы
Гликозидазы, используемые в структурном анализе Сахаров
Кобата IKobata) Акнра (р. 1933), японский биохимик. Окончил Токийский университет (1956), с 1982 г.— профессор этого университета. Известен трудами по изучению структуры углеводных детерминант гликопротеинов.
Гликозидазы
Нейраминидаэа Р Галактозидаза Р Маннозидаза а-Манноэндаэа а-Фукозидаза
Р - N - Ацетил глюкоз аминидаэа О-Галактозидаза Or-N-Ацетил галактозами ннд аза
Clostridium perfringens Vibrio cholcrae Clostridium perfringens Мука бобов канавалнн Яйцевод кур I Улитка j Мука бобов как а б ал и и I Aspergillus nigcr I Clostridium perfringens Aspergillus perfringens Эмульсин миндаля Clostridium perfringens Мука бобов канавалнн Aspergillus nigcr Aspergillus niger
Специфичность
a-NeuNAc-(2-»-6)-D-GalNAc 0>NeuNAc-[2-»-S(6)]-D-Gal 0-D-Gal-[l-*4(3)]-D-GlcNAc
He определена
a-D-Man-[l-*2(6,S)]-D-Man
Q-L-Fuc-(l-»'2)-D-Gal
a-L-Fuc-[l-3(4)]-D-Gal Широкая
Широкая Широкая
Оригинальная методика анализа структуры олигосахаридов, входящих в состав животных гликопротеинов, разработана А Кобатой На первой тадни олиго ахарид ные цепи отщепляются от полипептидной части молекулы обработкой безводным гидразином, а затем восстанавливаются NaB"'H4. давая меченные тритием производные
Последующие этапы анализа проводятся следующим образом: после кислотного гидролиза в виде ради ак ивнп меченного полиола и ентифицируется моносахарид, находившийся на восстанавливающем конце цепи. Далее путем восстановления моносахаридов NaB'H, и анализа смеси образующихся радиоактивно меченных альдитов определяется моносахарндный состав. Последовательность моносахаридов устанавливается с помощью экзогликозидаз: уменьшение молекулярной массы радиоактивно меченного олигосахарида, о котором судят по данным гель-фильтрации нв биогеле Р—4. свидетельствует об отщеплении соответствующего (отвечающего специфичности фермента) моносахарида. Число отщепившихся остатков удается опредепить, оценивая уменьшение молекулярной массы в условных «глюкозных единицах» (для этого используется колонка, калиброванная олиг мерами глюкозы разной длины). Наконец, анализ положения гликозндных связей проводится обычным образом с помощью метилирования. На различных этапах анализа широко практикуется сравнение с заведомыми образцами олигосахаридов.
Полисахариды
467
'Строение углеводов
Полисахариды (гликаны) представляют собой высокомолеку- и углеводсодержащих
лярные соединения, образующиеся при поликонденсации моносаха- биополимеров ридов. В состав гомополисахарида входит один, а гетерополисахарида — несколько типов моносахаридных остатков. Чаще всего в составе полисахаридов встречается D-глюкоза, но широко распространены также полисахариды, содержащие D-маннозу, D-галак-тозу, D-фруктозу, D-глюкозамин. Нередко полисахариды имеют заместители неуглеводной природы — остатки серной, фосфорной или органических кислот.
Большинство полисахаридов имеют тривиальные названия, часто в соответствии с источником, из которого они были выделены: целлюлоза, крахмал, хитин. Основой более строгий номенклатуры служит моносахаридный состав полисахарида: D-глюка ном называется полисахарид, построенный из остатков D-глюкозы, a D-ra-лакто D манианом — из остатков D-галактозы и D-маннозы.
Молекулярная масса полисахаридов колеблется в широких пределах — от нескольких тысяч до нескольких миллионов. Любой образец полисахарида в строгом смысле слова не гомогенен, а представляет собой смесь полимергомологоа. Для определения средне-числовых молекулярных масс полисахаридов используются в осноа-ном физические методы — осмометрия. светорассеяние и ультра-це нтри фу гн ро ва ние.
Широко варьируют и физические свойства полисахаридов. Большинство из них растворимы в воде, в то же время некоторые линейные полисахариды, являющиеся структурными компонентами клеточных стенок, в воде не растворяются и даже почти не набухают.
Полимерная природа полисахаридов определяет и их основные химические свойства. Вклад альдегидной группы незначителен, основную функциональную нагрузку несут гидроксильные группы. Как и в олигосахаридах, гликозидные связи в полисахаридах чувствительны к действию кислот.
Одна из сложностей работы с полисахаридами заключается в том, что не существует строгих критериев их гомогенности. Считается, что полисахарид индивидуален, если аналитические методы (хроматография, электрофорез, ультрацентрифугирование) не обнаруживают примесей, а различные способы очистки не меняют мономерный состав полисахарида и его физико-химические свойства.
Методы аыделения полисахаридов весьма разнообразны. К ним относятся экстракция (водой, щелочами, разбавленными кислотами), осаждение (спиртом, сульфатом аммония, бромидами цетилтриметиламмония и цетилпиридиния), хроматография (ионообменная, гельфильтрация), ультра фильтрация и ультрацентрифугирование.
Для установления строения полисахаридов необходимо охарактеризовать полимерные молекулы в целом с учетом регулярности их построения и определить молекулярную массу. Основным способом выяснения структуры полисахарида является расщепление полимера на олигосахаридные фрагменты, установление строения каждого фрагмента и воссоздание на их основе структуры исходного полимера. Большинство полисахаридов построено из повторяющихся олигосахаридных блоков: в этом случае задача сводится к расщеплению полисахаридной цепи, выделению повторяющегося звена и анализу его структуры.
В структурном анализе полисахаридов широко используются полный и частичный кислотный гидролизы. В связи с различной устойчивостью гликозидных связей к кислотному гидролизу и с раз-
468
Углеводы
Кочетко Николай Константинович
(р. 1915), советский химик-органик, академик АН СССР (1979). Окончил Московский институт тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова (1939), с 1966 Г.— директор Института органической химии АН СССР. Предложил ряд новых методов синтеза углеводов, осуществил направленный синтез сложных полисахаридов. Исследовал структуру полисахаридов микробного происхождения.
личной растворимостью полисахаридов условия гидролиза существенно варьируют. Для полного расщепления наиболее часто используется 2 — 4 н. соляная (100 °С, 3 — 4 ч) или 2 н. серная кислоты (100 °С, 2 — 4 ч).
При частичном гидролизе гомополисахаридов в зависимости от условий получается набор олигосахаридов различной длины. В случае гетерополисахаридов нередко удается подобрать условия, при которых наблюдается предпочтительный гидролиз определенного типа связи, что приводит к образованию характеристических олигосахаридных фрагментов; такие фрагменты получаются, в частности, при гидролизе полисахаридов, состоящих из чередующихся остатков нейтральных Сахаров и уроновых кислот, например капсулярного полисахарида типа 111 пнеамококков
-3)-(i-D-GlcA-(1 -4)-h-D-Glc-(1 -
Модификации кислотного гидролиза — ацетолиз и метанолиз — имеют в ряде случаев преимущества перед обычным гидролизом. При ацетолизе (обработка 2 — 4%-ным раствором серной кислоты в смеси уксусной кислоты и уксусного ангидрида) устойчивость некоторых гликозидных связей отличается от таковой при гидролизе, что позволяет получить разные структурные фрагменты. Хорошие результаты дает сольволиз жидким фторидом водорода, проведение которого в различных температурных режимах позволяет расщеплять полисахариды с различной степенью избирательности.
Важным методом частичного расщепления полисахаридов является ферментативный гидролиз; при этом используются эндо-ферменты, расщепляющие полисахариды в середине цепи. Наиболее известный из таких ферментов — лизоцим, расщепляющий [Ш -*- 4)-гликозидные связи между остатками N-ацетилмурамоаой кислоты и N ацетилглюкозамина в полисахариде (муреине) клеточной стенки бактерий (см. с. 190).
Основная сложность применения к полисахаридам метода метилирования заключается в трудности достижения полноты реакции: поэтому, как правило, используется многократная обработка полисахаридов метилирующими агентами. Наилучшие результаты дает метилирование по Хакомори. Часто ис
