яться. В некоторый момент времени в какой-то точке геля концентрации антигена и антител станут таковыми, что сможет произойти иммунопреципитация, в результате которой появится полоса, изображенная на рис. 23.20, В слева. Положение этой полосы определяется несколькими факторами, в том числе концентрациями и коэффициентами диффузии всех участвующих в ее образовании реагентов. Полоса преципитации служит барьером для дальнейшей диффузии реагентов, вследствие чего ее положение будет оставаться стабильным. Как видно в средней части рис. 23.20,5, диффузия иммунологически неродственного антигена б не влияет на преципитацию а-анти-а. На рис. 23.20, В справа показано независимое образование полосы преципитации при взаимодействии антигена б с антителами к нему, присутствующими в антисыворотке. Таким образом, наличие или отстутствие каких-либо антигенов или специфичных к ним антител будет отражаться на наличии или отсутствии соответствующей полосы преципитации. Количество линий показывает количество имеющихся в геле систем антиген-антитело. Возможность с помощью иммунодиффузии разделить различные системы антиген-антитело предоставляет исследователю удобный способ оценки чистоты антигена или специфичности антител. Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер

23.6.2.4. Диффузия двух компонентов в двух направлениях (метод Ухтерлони)

Согласно этому методу [119], в стеклянной чашке Петри приготовляют гель на основе чистой агарозы. Затем в нем вырезают три или больше лунок, как показано на рис. 23.21. Антигены а я б добавляют в верхние лунки, а антисыворотку, содержащую антитела против обоих антигенов, — в нижнюю. При этом, как и в случае одномерной диффузии, каждая пара антиген-антитело будет формировать свою полосу преципитации независимо от наличия других таких пар в системе. Как видно на рис. 23.21, А, эта полоса должна выступать на одинаковую длину с обеих сторон от прямой, соединяющей лунки с антигеном и антителами. Если разные антигены находятся в различных лунках (рис. 23.21,В), то отдельные преципитирующие системы не будут взаимодействовать между собой и поэтому линии преципитации будут пересекаться. Однако если в обе лунки добавлен один и тот же антиген (рис. 23.21,Б), то каждая линия преципитации окажется барьером для дальнейшей диффузии образующих ее антигена и антител, что вызовет укорочение полосы преципитации со стороны второй лунки. Кроме того, диффузия антигена из этой лунки будет сдвигать зону избытка антигена, что приведет к искривлению обеих линий преципитации и объединению их друг с другом в одну изогнутую линию. Полное слияние

23. Взаимодействие антиген —антитело линии преципитации без шпор (в противоположность тому, что показано на рис. 23.21, Д и Г) называется линией идентичности. Ее появление свидетельствует о том, что антиген, находящийся в каждой из лунок, связывается со всеми антителами, способными взаимодействовать с антигеном, из другой лунки.

Значительную аналитическую мощность этого метода можно проиллюстрировать с помощью рисунка 23.21,Г. В левую лунку добавлены антигены а и б, в правую — антиген б, а антисыворотка содержит антитела как к а, так и к б. Если антитела к а в избытке, то взаимное расположение линий преципитации окажется таким, как показано на рис. 23.21, Г: со стороны левой лунки будут видны две линии, а со стороны правой — одна. Две линии, слившиеся в одну, будут соответствовать антигену б, а третья линия — антигену а. По длине пути, который прошли антигены, можно судить об их относительных концентрациях, если предположить, что коэффициенты диффузии обоих антигенов сравнимы, а антитела против каждого из них присутствуют в ровных количествах. Наконец, поскольку линия преципитации, соответствующая антигену а, не искривляется и не укорачивается вблизи правой лунки, это означает, что образец в данной лунке не загрязнен антигеном а и, кроме того, между двумя антигенами нет иммунологического перекреста.

Тщательный анализ результатов подобных экспериментов дает возможность обнаружить дополнительные детали, касающиеся наличия частичного перекреста между антигенами или антителами. В опытах, схемы которых приведены на рис. 23.21, Д и Е, в левую лунку добавляют антиген, имеющий две детерминанты а и б, в правую — антиген, имеющий одну детерминанту б, а в нижнюю — антитела против обеих детерминант. Если при этом антитела анти-а находятся в избытке, то взаимное расположение линий преципитации будет таким, как показано на рис. 23.21, Е. В результате взаимодействия антител к а с (аб)-частицами появится левая линия преципитации. Однако она будет служить барьером также и для диффузии антител к б, что приведет к укорочению правой линии преципитации. В то же время линия преципитации антигена б и антител к нему не оказывает влияния на диффузию антител к а, поэтому укорочения левой линии наблюдаться не будет. В результате возникнет шпора, изображенная на рис. 23.21,2?. Если же в избытке находятся антитела к б, то расположение линий преципитации будет соответствовать рис. 23.21, Д. В этом случае и (аб)-, и б-антигены связываются с одними и теми же антителами; поэтому будут иметь место искривление и слияние линий преципитации. Одновременно будет наблюдаться шпора, появляющаяся при взаимодействии антител к а с (аб)-антигеном. Если между антителами наблюдается частичный иммунологический перекрест, а антисыворотка представляет собой смесь антител, направленных против обоих антигенов, то тот компонент антисыворотки, который ответственен за образование доминирующей линии преципитации, определяет, каким будет взаимное расположение линий преципитации.

Необходимо еще раз подчеркнуть, что иммунологический перекрест, обнаруживаемый с помощью метода Ухтерлони, соответствует определенному ранее перекресту второго типа. Описанный метод оказывается непригодным для измерения различий в аффинности, необходимых для количественного описания иммунологического перекреста первого типа. Отметим также, что чувствительность метода можно увеличить, если использовать радиоактивпоме-ченный антиген, а преципитат детектировать с помощью радиоавтографии.

23. Взаимодействие антиген—антитело 23.6.2.5. Иммуноэлектрофорез

Некоторые системы антиген—антитело слишком сложны для того, чтобы их можно было изучать с помощью иммунодиффузии. Чаще всего сложность заключается либо в слишком большом количестве полос преципитации, либо в слишком близком расположении полос друг к другу. Метод иммуноэлект-рофореза сочетает в себе электрофорез и иммунодиффузию, идущую в направлении, перпендикулярном направлению электрофореза (рис. 23.22). На первом этапе тестируемые антигены разделяют с помощью электрофореза по заряду, а на втором происходит их диффузия, которая для каждого антигена начинается из той точки, до которой он дошел в ходе первого этапа. Это эквивалентно тому, что каждый антиген как бы начинает диффузию из своей лунки (см. рис. 23.22, А, справа). Затем в агаре вырезают горизонтальный желобок, который заполняют антисывороткой, содержащей антитела ко всем компонентам. После этого начинается иммунодиффузия между отделенными друг от друга антигенами и линейным источником антител. Результаты, полученные для смеси трех антигенов, оказываются близкими к результатам, полученным для трех антигенов, находящихся в отдельных лунках [119]. Искривление, слияние и укорочение линий преципитации можно анализировать точно так же, как было описано выше. Разрешение каждой полосы несколько ухудшается вследствие размытости источника диффузии во время электрофореза. Тем не менее, например, иммунодиффузия белков нефракционированной человеческой сыворотки, значительно облегчается, если сыворотку предварительно Подвергнуть электрофорезу. Если же диффузию начинать из одной общей лунки, то видимыми окажутся лишь наиболее широкие полосы, тогда как предварительное проведение электрофореза позволяет наблюдать отдельные линии преципитации, соответствующие каждому из разделенных компонентов. Если после этого в геле вырезать параллельно направлению электрофореза желобок и заполнить его моноспецифической антисывороткой, то в результате можно будет идентифицировать все полосы преципитации (см. рис 23.22,25). Иммуноэлектрофорез широко используется для обнаружения мие-

Рис. 23.22. Иммуноэлектрофорез. Образец, содержащий три компонента (а, б и в), подвергают электрофорезу в агарозном геле, что позволяет разделить антигены в горизонтальном направлении. Затем в геле вы-резают горизонтальный желобок, который заполняют антисывороткой, диффундирующей навстречу разделенным антигенам. Предварительное разделение делает ситуацию аналогичной той, когда три разных антигена первоначально добавляются в три различные лунки (А) [119]. В опыте Б для идентификации антигена в вырезают второй желобок, который заполняют моноспецифическими антителами против в. В опыте В данный метод был использован для идентификации миеломного белка в человеческой сыворотке. Сыворотки больного и здорового индивидов вносили в лунки, имеющие на фотографии вид небольших кружков, и затем подвергали электрофорезу. Далее вырезанные параллельно друг дру-

гу желобки заполняли различными антисыворотками, после чего в направлении, перпендикулярном направлению электрофореза, шла иммунодиффузия. У больного 1 {слева) наличие широкой полосы преципитации с анти-IgG и анти-и, но не с анти-Я, свидетельствует о присутствии монокло-нального белка (IgGx), так как поликло-нальные иммуноглобулины должны реагировать с антисыворотками против ооеих легких цепей. При взаимодействии сыворотки больного 2 (справа) с антителами против IgG и К получаются аномально широкие полосы преципитации, в то время как при взаимодействии с антителами против и реагируют лишь те иммуноглобулины, которые имеются у здоровых людей. Это свидетельствует о наличии в сыворотке больного 2 моноклонал ьного белка IgG?.. (Фотографии любезно предоставлены Theresa Wilson; национальные институты здоровья, отделение клинической химии.) Дж. А. Беряофски, А. Дж. Берковер

ломных белков в человеческой сыворотке. Тестируемую сыворотку вносят в лу