л. массой 6000 Да (10% по весу) [40] (а именно эти реактивы наиболее часто используются для данной цели) можно осадить практически все антитела, тогда как антиген будет оставаться в растворе. Например, осаждение полиэтиленглико-лем и центрифугирование, могут быть проведены в течение менее чем 2 мин, что дает возможность разделить связанный и свободный антигены раньше, чем произойдет сколько-нибудь значительная диссоциация, обусловленная эффектом разбавления вследствие добавления полиэтиленгликоля [41]. Отметим, что если используется не цельная сыворотка, то для образования макроскопического осадка необходимо добавить в качестве неспецифического носителя гамма-глобулин. Однако если мол. масса антигена значительно больше 30 000 — 40 000 Да или если антиген не имеет формы глобулы, то полиэтилен-гликоль в концентрациях, полностью осаждающих антитела, может также осадить более 10% свободного антигена, что в результате будет приводить к неприемлемо высокому уровню фона (неспецифического связывания в отсутствие специфических антител). В этих условиях необходимо использовать более специфические методы осаждения. Если антитела исходно относятся к некоему подклассу иммуноглобулинов G, связывающихся со стафилококковым белком А, то можно воспользоваться преимуществом высокого сродства белка А к IgG, взяв для осаждения антител либо сефарозу с пришитым к ней белком А, либо убитые формалином целые клетки стафилококков (штамм Cowan I). Поскольку и гранулы сефарозы, и клетки стафилококков представляют собой большие частицы, их можно легко осадить центрифугированием, а вместе с ними и антитела со связанным антигеном, тогда как свободный антиген при этом останется в растворе [42]. Если и эта процедура не удастся, то можно попытаться осадить антитела, используя специфичные вторые антииммуноглобулиновые антитела, полученные путем иммунизации животных другого вида. Этот метод применяется очень широко, однако он также весьма громоздок. Как будет показано ниже, максимальное осаждение происходит не в условиях избытка антител, а в «точке эквивалентности» — в середине кривой титрования, где антиген (в данном случае первые антитела) и антитела (антииммуноглобулиновые) находятся примерно в одинаковых концентрациях. Поэтому для достижения максимального эффекта надо определить точку эквивалентности путем титрования с помощью вторых антииммуноглобулиновых антител, а для поддержания концентрации иммуноглобулинов на постоянном уровне следует добавить иммуноглобулиновый носитель. Необходимо, однако, иметь в виду, что реакция преципитации идет весьма медленно, поскольку формирование преципитацион-ной сетки и образование агрегатов, достаточно больших для того, чтобы их можно было осадить, протекает значительно медленнее, чем собственно реакция антиген—антитело. В результате инкубация со вторыми антителами обычно занимает от 24 до 48 ч или даже больше, по сравнению с несколькими секундами, требуемыми для осаждения полиэтиленгликолем. Столь долгое время инкубации не только задерживает получение результатов, но приводит также к тому, что равновесие между антигеном и антителами, сдвигаемое вследствие разбавления реагентов при добавлении вторых антител, устанавливается на новом уровне. Поскольку при уменьшении концентраций уменьшается также образование комплексов (см. выше), чувствительность метода понизится, если Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер

увеличение объема образца, обусловленное добавлением вторых антител, не будет сведено к минимуму. Некоторые из этих трудностей могут быть преодолены повышением эффективности осаждения с помощью низких концентраций полиэтиленгликоля.

Другой метод разделения заключается в адсорбции свободного антигена на поверхности какого-либо реагента, так, чтобы антиген, связанный с антителами, оставался при этом в растворе. Наиболее широко для этой цели используются активированный уголь и тальк. Поскольку способность связываться с данными реагентами зависит от размеров и гидрофобностн антигена, активированный уголь и тальк могут использоваться для адсорбции лишь некоторых антигенов. Описанный метод недорог и достаточно быстр. Однако, чтобы получить с его помощью воспроизводимые результаты и избежать при этом адсорбции комплексов антиген—антитело, необходимо точно устанавливать и внимательно следить за рН, ионной силой и температурой. Более того, поскольку активированный уголь и тальк обладают высоким сродством к антигену, они могут конкурировать за связывание с ним с низкоаффинными антителами и тем самым сдвигать положение равновесия. Кроме того, так как активированный уголь является гасителем В-излучения в сцинтилляционной жидкости, его можно использовать лишь в том случае, когда для мечения берутся ^-излучаю-щие изотопы, например 1251.

23.3.1.2. Методы разделения на твердой фазе

При проведении РИА метод разделения на твердой фазе особенно удобен тогда, когда необходимо обработать большое количество образцов. Преимуществом его является потенциальное увеличение аффинности антитела к лиганду по сравнению с собственной (intrinsic) аффинностью (что обусловлено обсужденными выше эффектами на границе твердой и жидкой фаз). Однако данный метод имеет и недостатки, связанные с тем, что в нем вследствие этих же самых эффектов измеряется не истинная собственная (true intrinsic) аффинность. Сам по себе метод достаточно прост. Сначала необходимо пришить антитела к твердой поверхности, например к гранулам сефарозы, на стенку пробирки или пластиковой лунки. В последнем случае, поскольку большинство белков неспецифически сорбируется на пластике (на поливинилхлориде легче, чем на полистироле), то обычно просто инкубируют антитела в пластиковой лунке, а затем таким же образом другим белком (например, бычьим сывороточным альбумином) заполняют незанятые места. Чтобы избежать при этом конкуренции со стороны других сывороточных белков, на данной стадии необходимо использовать только очищенные антитела. Концентрацию сорбирующихся антител можно менять, варьируя тип пластика или концентрацию антител в среде. После того как стенки лунок (или гранулы сефарозы) покроются слоем антител, в этих лунках инкубируют меченый антиген в присутствии или в отсутствие немеченого конкурирующего антигена, и после отмывки прямо измеряют количество радиоактивной метки, адсорбировавшейся на стенках (для этого предварительно вырезают данную ячейку из пластикового планшета) или на гранулах сефарозы. Метод связывания со стенками лунок пластикового планшета особенно полезен для обработки большого количества образцов. Однако, поскольку концентрация или даже количество адсорбировавшихся на стенках антител неизвестны и поскольку определяемая таким образом аффинность не является собственной аффинностью, этот метод нельзя использовать для получения химических характеристик реакции антиген—антитело. К тому же с помощью данного метода обычно определяют лишь концентрацию связанного антигена и очень редко п^и этом измеряют независимо концентрацию свободного антигена. Тем не менее если требуется узнать концентрацию неизвестного конкурентного антигена путем сравнения результатов эксперимента со стандартной кривой, то для данной задачи метод связывания на стенках пластиковых лунок, по-видимому, является идеальным. Детальный анализ того, при каких значениях параметров этот метод дает наилучшие результаты, осуществили Цоллин-гер и др. [43].

23,3.2. Определение концентраций антител и меченого антигена, соответствующих максимальной чувствительности

Основное, что определяет чувствительность метода,— это аффинность антител, концентрация антител и меченого антигена, а также точность (воспроизводимость) получаемых данных. В целом при более высокой аффинности можно добиться большей чувствительности. Если же антитела обладают очень высокой аффинностью, то это будет ограничивать диапазон, в пределах которого можно варьировать другие параметры. Например, поскольку в ходе эксперимента находящийся в исследуемом образце немеченый антиген конкурирует с меченым, то утверждение о том, что чем ниже концентрация метки, тем меньшую концентрацию антигена в неизвестном образце можно измерить, будет справедливо лишь до определенного предела. Этот предел, как следует из приведенных выше теоретических рассуждений, определяется величиной аффинности Касс [36]. Самый крутой участок кривой титрования соответствует концентрациям, близким к 1/Касс. При концентрациях лиганда, значительно меньших l/Kacc, большинство антигенсвязывающих участков остается незанятым, вследствие чего конкуренция оказывается менее эффективной. Поэтому нет никакого смысла уменьшать концентрацию метки до такого уровня, при котором Касс превышает ее более чем в несколько раз. Следовательно, хотя в целом увеличение удельной радиоактивности меченого антигена и уменьшение его концентрации представляется полезным, однако при этом важно помнить о существовании предельного значения концентрации 1/Касс. Увеличение удельной радиоактивности, более чем это необходимо для достижения максимальной чувствительности, может приводить к денатурации антигена, а слишком сильное ее уменьшение будет неизбежно вызывать неудобства, связанные с удлинением времени счета.

Аналогичным образом понижение концентрации антител будет до определенного предела приводить к увеличению чувствительности. Этот предел также зависит от значения ПКасс и от величины фонового «неспецифического связывания». Ясно, что уменьшение концентрации антител до того значения, когда связывание метки в отсутствие немеченого антигена становится слишком близким к уровню фона, будет приводить к потере чувствительности вследствие понижения точности. В целом условия эксперимента должны быть такими, чтобы часть метки, связанной в отсутствие конкурента, была больше, чем 0,2 и как можно ближе к 0,5 (см. [44]).

Удобный способ получения оптимальных концентраций метки и антител заключается в следующем. Прежде всего необходимо определить наименьшую концентрацию метки, которая дает требуемую точность счета за достаточно удобное время счета и точность счета при связывании от п