рассеяния и флуоресценции могут быть представлены различными способами. Представление сигналов светорассеяния и флуоресценции в масштабе реального времени дает распределение точек на осциллографе, которое позволяет оператору выбрать подходящий режим усиления (рис. 29.2, А). Эта осциллограмма может быть также записана, так как является быстрым и простым способом представления сигналов светорассеяния и флуоресценции данной клеточной популяции. Однако для анализа данных по одному параметру необходима кривая флуоресценции. Такую кривую можно получить с помощью анализатора амплитуды импульса, который

о

Интенсивность флуоресценции

Рис. 29.4. Гистограмма флуоресценции мышиных клеток селезенки, окрашенных меченными флуоресцеином кроличьими антителами против 6-цепей lg мыши (.4, непрерывная линия) и меченными техасским красным кроличьими антителами против р-цепей lg мыши (Б, непрерывная линия)

Интенсивность флуоресценции

или конъюгированными с флуоресцеином (А, непрерывная линия) и техасским красным (Б, пунктирная линия) кроличьими антителами к ферритину. В этих опытах шкала интенсивности флуоресценции делится на 1000 каналов.

подсчитывает число клеток, дающих сигнал определенной силы, и строит соответствующую гистограмму, где по оси ординат откладывается число клеток, а по оси абсцисс — сила сигнала (рис. 29.2, Б и В). Большинство анализаторов амплитуды импульса обладают устройством, позволяющим интегрировать полученные кривые, так что можно определить частоту клеток с данной интенсивностью светорассеяния/флуоресценции. Так, например, полученная с помощью анализатора амплитуды импульса кривая флуоресценции мышиных клеток, меченных окрашенными техасским красным кроличьими антителами против р.-цепей lg мыши, характеризуется распределением клеток, показанным на рис. 29.4, Б, причем р>положительные клетки составляют 49% от всей популяции спленоцитов. При отсутствии системы хранения данных, распределение точек на осциллографе или кривая флуоресценции могут быть сфотографированы, что довольно трудоемко и существенно ограничивает возможность последующего анализа данных. Очевидно, что в лабораториях, располагающих проточными микрофлуориметрами, такой метод хранения данных не позволяет использовать весь аналитический потенциал этих приборов. Например, при нормальных условиях работы через микрофлуориметр проходит 1500 анализируемых клеток в секунду. Если 25% этих клеток можно отбросить на основе их показателей светорассеяния, чтобы исключить из анализируемого материала клеточные агрегаты и нежизнеспособные клетки, то анализируется 1125 клеток И. Шер, М. Дж. Мэйдж

за секунду и за 23 с будут накоплены характеристики 25 ООО клеток. В серии образцов, окрашенных одной и той же флуоресцентной меткой, не нужно подстраивать усиление сигнала флуоресценции или светорассеяния для каждого образца, так что не составляет труда провести анализ и накопить от 10 ООО до 20 ООО клеток менее чем за 1 мин. Таким образом, зачастую анализируются сотни образцов в день, а в некоторых лабораториях их число доходит до тысячи.

Для быстрого накопления такого количества информации, простого ее извлечения и анализа требуется компьютер соответствующего уровня. Данные, полученные с помощью анализатора амплитуды импульса, могут храниться в памяти компьютера, в течение считанных секунд могут быть записаны на дисках, магнитной ленте или на любых других записывающих устройствах. Многие приборы позволяют оператору вводить данные в память компьютера в то же самое время, когда исследователи обращаются к информации от предыдущих опытов. Кроме того, исключительные вычислительные возможности компьютеров могут быть использованы для анализа данных. Например, кроме определения частоты клеток с данной интенсивностью светорассеяния и флуоресценции, можно определить среднее значение, медиану, коэффициент вариации и(или) канал, соответствующий пику флуоресценции или светорассеяния. Можно и непосредственно сравнивать различные образцы, накладывая друг на друга полученные кривые (рис. 29.4, А и Б). Так, на рис. 29.4, А сравниваются кривые флуоресценции клеток селезенки, окрашенных кроличьими ФИТЦ-ме-ченными антителами против б-цепей lg мыши и кроличьими ФИТЦ-антиферри-тин-антителами (контроль на неспецифическое окрашивание).

Наличие компьютера для хранения, извлечения и анализа информации, полученной с помощью проточных микрофлуориметров, имеет особенно важное значение в тех случаях, когда исследования ведутся по двум параметрам. В принципе при таком анализе распределение светорассеяния данной клеточной популяции используется для того, чтобы исключить из анализа все, кроме исследуемых жизнеспособных клеток, а интенсивность флуоресценции по двум параметрам оценивается для каждой исследуемой клетки. Большинство приборов представляет эти данные в виде распределения точек на осциллографе и необходимость в компьютере отпадает, но, как отмечалось ранее, возможность анализа ограничена, если для хранения информации используется фотографический метод. В случае определения двойной флуоресценции прибор должен регистрировать, а компьютер запоминать два независимых параметра для каждой клетки. Интенсивность сигнала для каждого параметра обычно делится на меньшее число каналов, чем в случае определения флуоресценции по одному параметру. Так, при анализе данных исследования по одному параметру с использованием 1000 каналов существует 1000 условных состояний, характеризующих клетки. В случае исследования по двум параметрам с использованием 1000 каналов должно быть уже 10002 или 106 условных состояний. Снизив число каналов до 64 при исследовании по двум параметрам, клетки можно распределить по 642 или 4096 условным состояниям, число которых позволяет проводить быструю компьютерную обработку данных, хранить и вызывать информацию. Однако снижение числа каналов снижает разрешающую способность анализа, как это проиллюстрировано на рис. 29.5. Эта кривая флуоресценции по одному параметру получена при анализе по двум параметрам мышиных клеток селезенки, окрашенных кроличьими ФИТЦ-анти-б-Ат и кроличьими анти-р-Ат, конъюгированными с техасским красным. Сравнение кривой, полученной при анализе по одному параметру с использованием ФИТЦ-анти-р-Ат, с анализом той же популяции клеток по двум параметрам (рис. 29.4 и 29.5 соответственно) демонстрирует различие между этими двумя видами микрофлуорометрии.

29. Разделение и идентификация клеток Существуют разные способы анализа данных по двум параметрам. Кривая для одного параметра (одной флуоресцентной метки), представленная на рис. 29.5, получена с помощью компьютерной программы SLICE. Эта программа позволяет исследователю выбирать определенные каналы интенсивности флуоресценции первой метки, которая не приводится на графике, так что представлено только распределение флуоресценции второй метки. На рис. 29.5, А все клетки, окрашенные меченными техасским красным антителами против р,-цепей (Тк-анти-ц.-Ат), селектированы, так что на полученной

о

Интенсивность флуоресценции Интенсивность флуоресценции

Рис. 29.5. Гистограммы флуоресценции мышиных клеток селезенки, окрашенных меченными флуоресцеином кроличьими антителами против 6-цепей lg мыши (А, непрерывная линия) и меченными техасским красным кроличьими антителами против ц-цепей lg мыши (Б, непрерывная линия)

или конъюгированными с флуоресцеином (А, пунктирная линия) и техасским красным (Б, пунктирная линия) кроличьими антителами против ферритина. В этом случае шкала интенсивности флуоресценции делится на 64 канала.

кривой представлены все (ФИТЦ-анти-б-Ат)-положительные клетки. Если интерес представляет распределение поверхностного IgD на sIgM-отрицательных, sIgM-положительных «бледных» или sIgM-положительных «ярких» клетках, то можно получить кривые флуоресценции именно этих клеток. Аналогично этому, кривую флуоресценции клеток, окрашенных Тк-анти-р,-Ат, можно получить при анализе всей или части кривой, полученной при окрашивании ФИТЦ-анти-б-Ат (рис. 29.5, Б). Следует отметить, что в отличие от бимодального распределения, наблюдаемого при окрашивании клеток ФИТЦ-анти-б-Ат, кривая флуоресценции клеток, окрашенных ФИТЦ-анти-р,-Ат, характеризуется большим числом sIgM-положительных клеток, интенсивность флуоресценции которых лишь немного превышает уровень фоновой флуоресценции slgM-отрицательных клеток.

Кроме этого метода существует и другой. В этом случае данные анализа по двум параметрам часто представляют в виде изометрического изображения (рис. 29.6), являющегося удобным способом демонстрации распределения популяций клеток после промечивания двумя флуоресцирующими реагентами. В данном конкретном исследовании наблюдается большой пик slgM-, slgD--клеток. Если анализировать клетки, несущие slgD, то обнаруживается, что большинство sIg+-KneT0K приходится на участок кривой с низкой интенсивностью флуоресценции IgM; следовательно, эти клетки обладают низкой плотностью поверхностных IgM (slgM — от англ. surface). Напротив, клетки, на которых slgD отсутствует или присутствует в очень малом количестве, экспрессируют промежуточный или высокий уровень slgM. Те же данные могут быть представлены в виде контурной карты с различными уровнями, обозначающими И. Шер, М. Дж. Мэйдж

Рис. 29.6. Изометрические кривые флуорес- красным кроличьими антителами против

ценции по двум параметрам мышиных кле- р-цепей lg мыши (интенсивность флуорес-

ток селезенки, окрашенных меченными ценции 2). Представлены две проекции

флуоресцеином кроличьими антителами про- одних и тех же данных, развернутые отно-

тив б-цепей мыши (интенсивность флуорес- сительно друг друга на 180°. ценции 1) и конъюгированными с техасским

определенное число клеток. Напротив, на рис. 29.7 показаны четыре уровня, представляющие 5, 10, 20 и 30 клеток. Все точки контурной карты с 5, 10, 20 и 30 клетками соединены сплошной линией. Точки, лежащие вне каждой линии, представлены менее чем 5, 10, 20 или 30 клетками соответственно, тогда как точки внутри линий, соответствуют бо