Биологический каталог




Основы энзимологии

Автор В.К.Плакунов

ащения малаша и фумарата протекает таким образом, что отщепляется (или присоединяется) только атом Н, находящийся в npo-R-положении, тогда как атом Н, находящийся в про-S-положении, не затрагивается.

н соо~ но СОО' н СОО"

\ / d.o \ / \ /

С = С -> Н -- С —С -* С =С + D.0

/ \ фуиаряа* / ^\ фумараэя / \

~ООС Н "ООС н D, "ООС н

Доказательством абсолютной стереоспецифичности фермента служит полное удаление дейтерия из молекулы маната в процессе его превращения в фумарат.

3.3. Методы изучения специфичности ферментов

Обычно степень специфичности ферментов оценивают на основании их способности катализировать превращения аналогов главного субстрата. Но применяемые подходы не всегда можно признать корректными, поэтому абсолютно необходимо соблюдать следующие условия.

1. Фермент должен быть высокоочищен, он не может содержать даже следов других ферментов, действующих на сходные субстраты. Использовать фермент следует в минимальной концентрации.

28

2. Субстраты максимальной чистоты не должны содержать других веществ, на которые действует данный фермент. Оптические изомеры нужно исследовать раздельно, так как присутствие одного из них может влиять на превращение другого (например, D-acna-рагин конкурентно подавляет дезаминирование L-аспарагина, катализируемое аспарагиназой).

3. Необходимо использовать серию концентраций каждого субстрата и вычислить кинетические параметры (Кт и Vmax). В случае субстратов, способных к ионизации, следует определить зависимость кинетических параметров от рН.

4. Если в ферментативной реакции участвует более одного субстрата (например, донор и акцептор), необходимо изучить специфичность фермента по отношению к субстратам каждого из этих рядов.

5. Особый случай может быть обусловлен наличием у одного и того же фермента двух или более активностей в соответствии со схемой:

А-*В-»С или С<-А-»В.

Здесь необходимо доказать, что дополнительная активность не связана с присутствием другого фермента. Можно использовать следующие критерии:

— эти активности не должны разделяться разными методами фракционирован ия;

— должно сохраняться постоянное количественное соотношение активностей в процессе инактивации фермента (путем нагревания, облучения, изменения рН, действия ингибиторов и т.д.);

— при одновременном добавлении субстратов (в концентрациях, близких к насыщающим) общая скорость должна быть меньше суммы скоростей, измеренных для каждого субстрата отдельно.

Очевидно, что два последних критерия справедливы только для ферментов, имеющих общий каталитический центр для изучаемых субстратов. При наличии двух разных каталитических центров их свойства могут настолько различаться, что имитируется реакция смеси ферментов. С другой стороны, физико-химические свойства двух разных ферментов могут оказаться настолько близкими, что их не удастся разделить методами фракционирования. Поэтому убедительным доказательством может служить только комплексное исследование.

29

3.4. Природа связей между молекулами фермента и субстрата

При наличии в молекулах субстратов заряженных групп (например, у аминокислот) связывание их с ферментами происходит преимущественно за счет электростатических сил. При этом распределение зарядов в молекулах субстрата и фермента должно быть комплементарным (т. е. положительно заряженным участкам фермента должны соответствовать отрицательно заряженные группы субстрата, и наоборот).

При отсутствии заряженных групп у гидрофильных (полярных) субстратов (например, Сахаров) взаимодействие должно быть обусловлено водородными связями.

В случае незаряженных гидрофобных (неполярных) субстратов (например, содержащих углеводородные цепи) взаимодействие должно быть обусловлено гидрофобными (вандерваальсовыми) силами.

В случае металлоферментов взаимодействие с субстратами может быть обусловлено образованием координационных связей между лигандными группами субстрата и атомом металла.

Доказательством природы связи субстрата и фермента (кроме физических и физико-химических методов) может служить подавление активности фермента (связывания субстрата) специфическими ингибиторами (комплексонами, поливалентными ионами, веществами, разрушающими водородные или гидрофобные связи).

3.5. Принципы классификации и номенклатуры ферментов

Для корректного описания ферментов необходимо знать их обозначение по современной классификации. В соответствии с решением Международной комиссии для каждого фермента установлен код, состоящий из четырех чисел, разделенных точками. Первое число означает, к какому из шести основных классов относится фермент; второе указывает подкласс (как правило, природу донора); третье — подподкласс (как правило, природу акцептора); четвертое число — это порядковый номер фермента в его подподклассе. Основными группами ферментов в настоящее время принято считать следующие классы.

1. Оксидоредуктазы, катализирующие окислительно-восстановительные реакции. В названиях используются термины дегидрогенаэа или редуктаза, а если акцептором является молекулярный кислород, то оксидаза:

30

1.1 — действуют на СНОН-группу доноров;

1.1.1 — акцепторами служат NAD+или NADP+.

Таким образом, первый фермент этого класса — алкогольде-гидрогеназа обозначается так: 1.1.1.1 Алкоголь: NAD оксндоредук-таза

Этанол + NAD+ -> ацетальдегид + NADH.

2. Трансферазы, катализирующие перенос тех или иных групп, например аминотрансферазы: 2.6.1.2 L-аланин — оксоглутарат ами-нотрансфераза

Алании + 2-оксоглутарат -> пируват + глутамат.

3. Гидролазы, катализирующие перенос групп на молекулу воды, например 3.1.2.1 Ацетил-СоА-гидролаза

Ацетил-СоА + Н20 ~» ацетат + СоА.

4. Лиазы, катализирующие образование двойных связей или присоединение по двойным связям, например: 4.1.3.1 трео-О-изо-цитрат глноксилат-лиаза (изоцитратлиаза)

Изоцитрат -у сукцинат + глноксилат.

5. Изомеразы, катализирующие изменение геометрической или пространственной конфигурации молекул, например: 5.1.1.1 Ала-нннрацемаза

L-аланин -> D-аланин.

6. Лигазы, катализирующие соединение двух молекул, сопровождающееся гидролизом богатой энергией связи, например: 6.2.1.1 Ацетат: СоА лигаза

Ацетат + СоА + АТР -> ацетил-СоА + AMP + пирофосфат.

Несмотря на общепринятые требования к обозначению названий ферментов в научной литературе (в соответствии с международной классификацией), нередко встречаются и старые, более простые названия ферментов.

X-

Глава 4. Кинетика действия ферментов

Кинетические исследования ферментативных реакций необходимы не только для количественного определения ферментов и сравнения скоростей их функционирования, но, в еще большей степени, для расшифровки мехвнизмов ферментативных реакций. В этих целях прежде всего необходимо уметь корректно вычислять кинетические парвметры ферментативных реакций, оцениввть конкурентный или неконкурентный характер действия ингибиторов. Рассмотрим основные уравнения, описывающие ферментативную кинетику и способы вычислений. Основное внимание будет уделено не строгос

страница 8
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33

Скачать книгу "Основы энзимологии" (0.9Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(22.09.2019)