Биологический каталог




Основы энзимологии

Автор В.К.Плакунов

ти математического вывода уравнений, а правильному их использованию для получения достоверных результатов.

При выводе кинетических уравнений (в частности, уравнения Михаэлиса—Ментен) количественно характеризующих ферментативную активность, обычно делают следующие допущения.

1. Фермент и субстрат образуют фермент-субстратный комплекс за счет сил физической природы. Из этого комплекса в дальнейшем освобождаются фермент и продукт. Таким образом, химической реакцией является только второй этап — распад фермент-субстратного комплекса:

2. Концентрация субстрата обычно значительно выше концентрации фермента. Поэтому при рассмотрении начальных скоростей реакции, когда концентрация продукта очень низка ((Р] = 0), обратимостью второй стадии можно пренебречь. Следовательно, [ES] — const., а скорость образования продукта равна (по уравнению реакции первого порядка):

E + SrJll-»ES< ttJ >Е + Р,

---^ТГ

(1)

(3)

(2)

Поскольку общая концентрация фермента [Е0] равна сумме концентраций свободного фермента [Е] и фермента, связанного в комплекс [ES], то

[Е0] = [Е] + [ES] или [Е] = [Е0] - [ES]. (4)

С другой стороны, из уравнения (3) следует:

Подставляя значение [Е] = [Е0] — [ESf из (4), получаем:

[E0][S]

[ES] Ks = [EJ [S] - [ES] [SI или [ES] = (5)

Подставив выражение (5) в уравнение скорости V = k+2 [ES], получим:

ic^Msj

KB+[S] " (6>

В уравнении (6) выражение k+2 [Е0] можно рассматривать как максимальную скорость, достигаемую, когда концентрация фермент-субстратного комплекса численно равна общей концентрации фермента (т. е. когда весь фермент связан в комплекс). Следовательно:

? = или, принимая К, = ]^, ^^щ- (7)

Выражение (7) есть не что иное, как уравнение Михаэлиса— Ментен для ферментативной кинетики, а величина Кга = Ks представляет собой меру сродства фермента к субстрату. Численно она равна такой концентрации субстрата, при которой начальная скорость ферментативной реакции составляет половину максимальной скорости. Уравнение (7) графически выражается гиперболой (рис. 11).

Для практического определения кинетических параметров этот график неудобен, к тому же требует использования концентраций субстрата, «насыщающих» фермент, что не всегда достижимо при ограниченной растворимости субстрата. Поэтому обычно стремятся преобразовать уравнение Михаэлиса—Ментен в такую форму, чтобы графически оно изображалось прямой линией. Чаще

33

VHa4 = V™

При = VrmxJ2 S = Km

Km концентрация субстрата( S )

Рис 11. График Михаэлиса—Ментен

всего для этого используют метод Лайнуивера—Берка, представляя уравнение Михаэлиса—Ментен в виде уравнения прямой линии (у = а + Ьх):

V V^S vmaxs+vmaxs vmax+vm„'s

1 . + .К- U

Последнее выражение называют уравнением Лайнуивера—Берка и для расчета кинетических параметров используют график, построенный в координатах: 1/V против 1/S. В результате получается прямая, отсекающая на оси ординат отрезок, равный 1/V , а на продолжении оси абсцисс отрезок, равный — 1/Кга(рис. 12). Однако следует отметить, что при использовании графика Лайнуивера—Берка точки в области высоких концентраций субстрата располагаются слишком густо, а положение прямой линии во многом зависит от точек в области низких концентраций субстрата, где определение скорости менее надежно. Кроме того, реаль-

* в научной литературе в целях упрощения, концентрации компонентов принято обозначать без квадратных скобок, т.е. [S] = S.

34

ные экспериментальные данные не всегда адекватно аппроксимируются в виде прямой линии.

Поэтому предложено еще несколько приемов для определения кинетических параметров. Метод Эди—Хофсти также основан на преобразовании уравнения Михаэлиса—Ментен. Умножив обе части уравнения на и преобразовав, получим:

YmL = l + ^L или Vmtx = V + Km| или У-Л^-К^.

График этого уравнения в координатах V против V/S представляет собой прямую линию, отсекающую на осях ординат и абсцисс отрезки, равные VmaxH Vm>x/ Кго соответственно (рис. 13).

В некоторых случаях (при сильном варьировании результатов определения скорости ферментативной реакции) для вычисления кинетических параметров удобнее использовать метод Эйзен-таля и Корниш—Боуден, основанный на преобразованном уравнении Михаэлиса—Ментен:

Vm„ = V + |-Km.

В этом случае для каждого значения V и S строится прямая в координатах V и S. Точка пересечения всех этих прямых имеет координаты: Vmax (ордината) и Кт (абсцисса) (рис. 14).

35

V

X-

Глава 5. Ингибирование ферментов

Изучение подавления активности ферментов служит одним из способов расшифровки механизма их действия. Подходом к решению последней задачи является изучение специфичности действия ферментов. В свою очередь, это требует корректного измерения кинетических параметров в присутствии изучаемого аналога субстрата. Рассмотрим способы определения характера взаимоотношений субстратов, их аналогов и ингибиторов ферментативной активности путем вычисления ряда кинетических параметров.

Ингибиторы ферментов можно разделить на две основные группы: обратимые и необратимые. После удаления (например, путем диализа) ингибитора первого типа активность фермента восстанавливается; во втором случае ингибитор удалить не удается или активность фермента не восстанавливается даже после удаления ингибитора (наступает денатурация ферментного белка). Необратимое ингибирование достигает максимума, когда весь фермент связан с ингибитором. Обратимое ингибирование достигает состояния равновесия, положение которого определяется константой ингибирования (К;), характеризующей сродство фермента к ингибитору. Схема обратимого ингибирования приведена ниже:

Е + S -> ES -> Е + Р I- ингибитор + + EI — комплекс: фермент— I I ингибитор Т4- f-J- EIS— комплекс: фермент-El + S ^ EIS. ингибитор—субстрат

При этом, если константа диссоциации комплекса Ks = Km равна:

^ - [ES] '

37

то константа ингибирования определяется следующим соотношением:

гам

При конкурентном ингибировании субстрат и ингибитор связываются с одним и тем же активным центром фермента. В присутствии ингибитора снижается сродство фермента к субстрату (повышается величина Кт). Величина не изменяется, так как при «насыщающей» концентрации субстрат вытесняет ингибитор из комплекса с ферментом.

При неконкурентном ингибировании субстрат и ингибитор связываются с разными центрами фермента. При этом величина Кга не изменяется, а величина Vmax снижается.

Возможны также промежуточные или альтернативные случаи, например, когда ингибитор связывается не с ферментом, а с фермент-субстратным комплексом, как в случае бесконкурентного ингибирования, при котором изменяются оба кинетических параметра.

Для определения типа ингибирования обычно используют график Лайнуивера—Берка, полученный для данного субстрата в отсутствие и в присутствии ингибитора.

При конкурентном ингибировании, если определена величина Кт в присутствии ингибитора (обозначим ее Кга1), можно рассчитать константу ингибирования (К.) по следующей фо

страница 9
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33

Скачать книгу "Основы энзимологии" (0.9Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.09.2019)