74; Srivastava, Huystee, 1977].

Механизм оксидазного окисления ИУК впервые предложили Рикард и Джоб [Pvicard, Job, 1974], которые указали на специфичность реакции и предложили механизм превращения ИУК в ин-дол-3-альдегид, происходящего непосредственно в активном центре пероксидазы. Ими было установлено, что радикал ИУК может удерживаться молекулой белка и реагировать с кислородом с образованием соединения II (Е2):

Е-1АА- + 02 -> Е2 + Ind-CH20 + С02

Ind-CH20 — гипотетический интермедиат, индол-3-эпоксид.

34

Пероксидаза — катализатор биогенных систем

Подробное исследование этой реакции позволило установить, что пероксидазы растений являются высокоспецифичными ок-оигеназами ИУК и реакционный цикл начинается с образования тройного комплекса фермент-ИУК-кислород, приводящего к катион-радикалу ИУК [Gazaryan et al., 1996]:

Е3+ + IAA <-> [Е — IAA] + 02 <-> [Е — IAA — 02] [Е — IAA — OJ —> Е + 1АА+ + 02-.

1АА"+ — катион-радикал ИУК, а 02' — супероксид анион-радикал.

В кислой среде катион-радикал ИУК декарбоксилируется и превращается в радикал скатола [Gazaryan et al., 1996]. Радикалы скатола реагируют с молекулярным кислородом, образуя перок-си-радикалы [Gazaryan et al., 1998] и далее перекись скатола по реакции [Gazaryan, Lagrimini, 1998]:

IAA + -» InCH2- + CO, InCH2- + 02 -» InCH2Cy InCH202- + IAA -» InCH2OOH + IAA-

IAA- — индолил-радикал, InCH2-, InCH202-, InCH2OOH — радикал, ne-рокси-радикал, перекись скатола соответственно.

Исследуя реакцию оксидазного окисления ИУК, катализируемое пероксидазой хрена, было высказано предположение, что фермент способен одновременно связывать как перекись скатола, так и молекулу ИУК. Таким образом, в активном центре пероксидазы существует участок специфического связывания ИУК, отличающийся от области активного центра, где способна связываться и расщепляться перекись водорода или органическая гидроперекись [Gazaryan et al., 1996; 1998]. При этом перокси-. радикал превращается в активном центре фермента не повреждая его, тогда как перокси-радикалы, образующиеся при окислении фенолов в аэробных условиях, инактивируют фермент [Ма, Rokita, 1988].

Оксидазные реакции, катализируемые пероксидазой, могут ускоряться другими соединениями. Такой эффект был выявлен при изучении индивидуального и совместного оксидазного окисления ИУК [Coldacre et al., 1953; Гуськов и др., 1985]. При этом отмечено, что скорость оксидазного окисления ИУК пероксидазой

35

Глава II

резко возрастало в присутствии 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты. Однако механизм реакции авторами не исследовался.

Таким образом, в реакциях оксидазного окисления, пероксидаза способна катализировать окисление органических соединений, среди которых могут быть и функционально активные вещества. Причем в каталитическом процессе участвует белковый компонент. Реакция сопровождается образованием продуктов свободноради-кального окисления которые приводят к образованию активных форм кислорода. При этом образующаяся перекись водорода взаимодействует с ферментом с образованием соединения I, которое инициирует пероксидазные реакции. По-видимому, в этом случае могут параллельно протекать как реакции оксидазного, так и пероксидазного окисления. Причем последние ускоряют окисление органических субстратов. Образование радикалов органических соединений может способствовать модификации функциональных групп белка, участвующих в катализе, что может приводить к инактивированию фермента, проявляемое в понижении скорости ферментативной реакции. Наличие данного процесса продемонстрировано в реакции оксидазного окисления диоксифумаровой кислоты [Березин и др., 19756]. Используя в качестве субстрата пероксидазы о-дианизидин, который окисляется только перекисью водорода и не окисляется кислородом. Показано, что в системе ДФК-ПО-02 наблюдается окисление о-дианизидина, причем скорость его окисления возрастала с увеличением концентрации ДФК. Поэтому образование перекиси водорода в ходе оксидазных реакций пероксидазы является пусковым механизмом для последующего протекания пероксидазных реакций фермента. Данный механизм может быть использован организмами, находящимися в состоянии покоя или гибернации, поскольку активизация оксидазных процессов в биогенной системе может служить пусковым механизмом для покоящихся систем, обеспечивая их энергетические потребности при выходе из состояния покоя.

2.2.2. ПЕРОКСИДАЗА В РЕАКЦИЯХ ПЕРОКСИДАЗНОГО ОКИСЛЕНИЯ СУБСТРАТОВ

2.2.2.1. Пероксидаза в реакциях индивидуального окисления субстратов

Реакция пероксидазы с перекисью водорода приводит к образованию нескольких промежуточных соединений, которые имеют характерные максимумы поглощения (табл. 2). Впервые эти

36

Пероксидаза — катализатор биогенных систем

соединения изучил Чане [Chance, 1943; 1949b; 1952], предложивший следующую схему взаимодействия пероксидазы с перекисью водорода:

E-OH+HCOR-^Ц -OOR+Hp

Образовавшееся соединение Е, неустойчиво и переходит в соединение Е2:

El-00R-^E2-COR

При наличии большого избытка перекиси соединение Е2 переходит в соединение Е3. Однако в присутствии донора водорода соединение Е2 восстанавливается до нативного фермента:

Е, -COR+DH, -*5->E-OH+D+ROH

Изучая реакции пероксидазы с различными донорами, Чане показал, что доноры электронов реагируют в 50—100 раз быстрее с соединением Ер чем с Е2 [Chance, 1952], поэтому им была предложена следующая схема:

Е+Н202—Ь->Е, E.+DH-^E.+D Ег+DH-^E+D

Е, Е,, Е2 — нативная и промежуточные полуокисленные формы фермента, DH — субстрат.

В настоящее время эта схема принята большинством исследователей, занимающихся изучением реакций пероксидазного окисления субстратов. Промежуточными соединениями пероксидазы в этих реакциях являются продукты окисления фермента перекисью водорода, а не комплекса фермента с субстратом [Jones, Dunford, 1978]. Образование соединения Е, происходит через ряд промежуточных стадий с формированием одного или более предшественников [Dunford, Hewison, 1977; Jones, Dunford, 1977].

Соединение E, является промежуточной формой пероксидазы с константой перехода в Е2 5 с-1 [Chance, 1949Ь]. Константа скорости образования Е, не зависит от рН в диапазоне от 3,5 до 11, а изменение температуры от 40 до 80 °С не влияет на про-

37

Глава II

филь рН-зависимости [Jones, Dunford, 1977]. Нитрат ингибирует образование соединения Ер связываясь внутри гемового «кармана», что проявляется в увеличении кажущейся рК дистальной каталитической группы [Araiso, Dunford, 1980]. Константа скорости начальной стадии взаимодействия пероксидазы с перекисью водорода является диффузионной [Dunford, Hewison, 1977], влияние на нее оказывает только природа перекиси. Важность гидрофобных взаимодействий для образования Е, показана на примере связывания пероксибензойных кислот с пероксидазой [Job, Jones, 1978], у которых сродство к ферменту возрастало с увеличением протяженности гидрофобного заместителя. Тогда как при взаимодействии пероксидазы с гидроперекисями большое значение приобретает электростатический фактор, так как ионизация п