Биологический каталог




Пероксидаза как компонент антиоксидантной системы живых организмов

Автор В.В.Рогожин

ерекисей приводила к полной остановке реакции [Davies et al., 1976]. Соединения Е, и Е2 представляют собой промежуточные окисленные формы пероксидазы. Переходы Е, —» Е2 и Е2 —» Е, являются одноэлектронными процессами. При этом Е, обладает двумя окисленными эквивалентами по сравнению с нативной формой фермента, а Е2 — одним. Методами спектроскопии ЯМР показано, что как в Ер так в Е2 железо присутствует в феррильной форме, т.е. имеет формальный заряд +4 [Maeda, Marita, 1967; Moss et al., 1969; Stillman et al., 1976]. Дополнительный окислительный эквивалент в молекуле Е, локализуется либо на порфириновом макроцикле, либо на одной из функциональных групп апобелка [Morishima, Ogawa, 1978; La Mar et al., 1981; Loew et al., 1977; Kaneko et al., 1980].

По реакционной способности окисляющиеся субстраты Дан-форд предложил разделить на три группы [Dunford, Stillman, 1976]: 1) легко окисляемые — фенолы и амины с электродонор-ными заместителями в бензольном кольце; 2) средне окисляемые — ферроцианид-, сульфит- и нитрит-ионы, а также фенолы и амины с электронно-акцепторными заместителями в бензольном кольце; 3) трудно окисляемые — иодид-ионы.

Механизмы реакций соединений Е1 и Е2 пероксидазы с различными субстратами различаются в зависимости от природы субстрата (табл. 4). Классифицируя субстраты по характеру взаимодействия с ферментом, соединения подразделяют на взаимодействующие и невзаимодействующие с гемом. Выделяя субстраты для которых возможен непосредственный контакт с

38

Пероксидаза — катализатор биогенных систем

Таблица 4

Величины каталитических констант реакций окисленных форм пероксидазы

(Ех и Е2) с различными фенолами [Critchlow, Dunford, 1972; Job, Dunford, 1976].

Фенолы с зшестителями к, 10-, MV' к, 10М'с 1

/i-NH2 23000 —

и-ОСН3 13000 —

0-ОСН3 900 300

л-CHj 4200 1000

л/-СН3 7900 —

л/-ОН 800 —

Н 280 —

л/-ОСН3 240 —

л-ОС,Н< 127 -

гемом (ферроцианид-, сульфит-, нитрит-, тиоцианат-ионы), и такие, для которых по данным спектроскопии ЯМР подобный контакт невозможен (ароматические фенолы и амины, другие органические соединения). Первая группа субстратов является донорами электронов, а вторая — донорами атома водорода [Лебедева, Угарова, 1996]. При этом пероксидазное окисление органических соединений может быть реализовано с использованием различных механизмов [Угарова и др., 1981]. Так, например, нетривиальный механизм выявлен в реакциях пероксидазного окисления р-крезола. Показано, что из рН-зависимости lgk2 определяется функциональная группа в активном центре фермента с рК ~ 5,0, протонирование которой ингибирует реакцию, тогда как для других субстратов пероксидазы протонирование группы с рК ~ 5,0 проявлялось в увеличении к2. Изучение реакции позволило прийти к заключению, что /ькрезол образует с соединением Е, комплекс Михаэлиса [Hewson, Dunford, 1976а], и ионизированная г?орма /?-крезола не реагирует с соединениями Е и Е2 [Critchlow, Dunford, 1972]. Установлено, что в данной реакции р-крезол взаимодействует с соединением Е, пероксидазы в соотношении (2:1). В соответствии с чем был предложен Механизм двухэлектронного окисления р-крезола [Hewson, Dunford, 1976b], согласно которому вместе с электроном переносится и протон:

E,+DH2->E2+DH-

DH-->1/2(DH)2

39

Глава II

E2 + 1/2(DH)2-»Е+Р

E,+(DH2)2->Е+Р

Е — пероксидаза, DH2 —/>-крезол, Р — продукт реакции.

Эта схема предложена Данфордом на основе аналогичной реакции гваякола с промежуточными соединениями пероксидазы, которая имела стехиометрию (2:1) [Santimone, 1975]. Аналогичная схема использовалась и для объяснения механизма пероксидазного окисления L-тирозина, где тоже наблюдается стехиометрия субстрата к Е,, равная 2:1 [Ralston, Dunford, 1978].

Для реакции пероксидазного окисления ферроцианида калия авторы предлагают схему, в соответствии с которой предполагаются стадии комплексообразования окисленного субстрата с промежуточными соединениями пероксидазы Е, и Е2 (Лебедева, 1980).

Е+Н202—*->Е, E+St-^E, -S—S->E2+P

E2+S<=^=iE2 -S—*a->E+P

Используя дейтерированную воду показано, что в реакции пероксидазного окисления ферроцианида с соединениями Е, и Е2 транспорт протона не является скорость—лимитирующей стадией [Dunford et al., 1978]. Тогда как в реакции окисления /ьамино-бензойной кислоты (ПАБК) лимитирующая стадия включает перенос протона [Hubbard et al., 1975]. Для объяснения сложного механизма окисления ПАБК была предложена следующая схема:

которую можно представить в виде последовательных реакций генерирования свободных радикалов.

E2 + DH2-»E+R-

Е2 +R-->Е2

R+DH2->R'-

E'2 + DH2->E+R-

R- — начальный свободный радикал окисленной ПАБК; R'- продукт реакции ПАБК с R-.

40

Пероксидаза — катализатор биогенных систем

R и R'- могут дальше реагировать с субстратами или другими донорами обычным свободнорадикальным путем. Механизмы реакций соединений Е, и Е2 пероксидазы с различными субстратами различаются в зависимости от природы субстрата. Так, восстановительный процесс с ферроцианидом калия происходит по одноэлектронному механизму [Лебедева и др., 1981], субстраты I- и HN03 осуществляют прямое восстановление соединения Е, до нативной пероксидазы [Itagaki, Palmer et al., 1967]. Величины Km не зависят от рН для реакции пероксидазного окисления ферроцианида и обнаруживают сильную зависимость от рН при рН > 7,0 в реакции пероксидазного окисления о-дианизидина [Лебедева, Угарова и др., 1977]. При рН > 6,0 Ц не зависит от рН для реакций пероксидазного окисления ферроцианида [Hasinoff, Dunford, 1970], /ьаминобензойной кислоты [Hasinoff, Dunford, 1970] и р-крезола [Ralston, Dunford, 1978] и уменьшается в случае нитрит-ионов [Roman, Dunford, 1973].

Изучение образования свободных радикалов в каталитической реакции пероксидазы при низкой температуре показало, что свободные радикалы в системе появляются только после перехода Е, в Е2 [Douzov, Leterrier, 1970]. С помощью ЭПР обнаружены промежуточные свободные радикалы в пероксидазных и оксидазных реакциях пероксидазы с фенолами, нафтолами и бензолами, а также в пероксидазных реакциях метгемоглобина.

В настоящее время установлен молекулярный механизм расщепления перекиси водорода в активном центре пероксидазы [Gajhede et al., 1996]. В механизме восстановления перекиси участвуют железо (111) протопорфирина IX и два ключевых ди-стальных аминокислотных остатка — His-42, Arg-38. В начале молекула перекиси водорода связывается в шестом координационном положении с железом гемина. Протон от перекиси переходит на гистидин, который выполняет роль основания. При этом аргинин обеспечивает перераспределение электронной плотности между атомами кислорода, способствуя гете-ролитическому расщеплению связи в молекуле перекиси водорода. Конечным этапом каталитического процесса является стадия, в которой происходит возврат гистидином протона гидроксилу, связанному с аргинином, и молекула воды покидает активный центр фермента. Перераспределение электронов приводит к образованию оксиферрильной формы гема

страница 11
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70

Скачать книгу "Пероксидаза как компонент антиоксидантной системы живых организмов" (3.56Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(22.09.2019)