зного окисления АК от ее концентрации в координатах Лайнуивера-Берка при концентрациях ферроцианида калия: 1—0, 2—20, 3—40, 4—60 мкМ; концентрации: пероксидазы — 0,1 мкМ, Н202 — 0,64 мМ, АК - 44-176 мМ, рН 5,0.

схема 4

E.-S.-^E+P, S Tpi

5Ъ E1S,^±E1-S1-2.S2-^E-S1+2P2

Е. +

S

' S2.vK, K4TiS2

ЕА<^Ь±Е, -S2 -S,^^E-S2 +Р, S2UK2 ^

e+2P2 -2S2 e+p5

60

Пероксидаза в реакциях окисления медленно и быстро окисляемых субстратов

Таблица 6

Величины каталитических констант совместного пероксидазного окисления ферроцианида калия и аскорбиновой кислоты

рН К,мкМ К,мкМ К,мкМ Kat «к Kat ' Ко, Р, «2 Pi

5,0 9,7 - - 17,6 - 260 0,23 3,9 -

5,5 10,8 370 0,003 6,8 38 220 0,11 3,3 3,8 2,4

6,0 6,1 200 0,009 8,4 24 150 0,18 1,6 5,5 2,3

7,0 11,5 330 0,016 3,7 17 40 0,21 4,7 4,4 2,7

Е, Е,, Е2 — нативная и окисленные формы фермента; S, — ферроцианид; S2 — аскорбиновая кислота; Е, — Sp Е, — S2, Е2 — Sp Е, — 2S2 — комплексы окисленных форм пероксидазы с субстратами, Е, — S2 — Sp Е, — S, — 2S2 — комплексы окисленных форм фермента с ферроцианидом и одной или двумя молекулами аскорбиновой кислоты; Кр Кр К3, К4 — константы диссоциации соответствующих комплексов окисленных форм ферментов с субстратами (ферроцианидом и аскорбиновой кислотой); кр к'сЛ, к*,, к", — каталитические константы.

Учитывая взаимное влияние в процессе пероксидазного окисления ферроцианида и аскорбиновой кислоты, можно предположить, что выявленные эффекты обусловлены близким расположением участков связывания обоих субстратов в активном центре пероксидазы, что сказывается на их пероксидазном окислении. Преимущественное окисление донора водорода, возможно, обусловлено конформационными перестройками в соединениях Е, и Е2, предварительное связывание с которыми ферроцианида улучшает последующее связывание и превращение двух молекул аскорбиновой кислоты. Наблюдаемый эффект субстрат-субстратной активации и ингибирования в реакциях, катализируемых пероксидазой, обусловлен взаимной конкуренцией субстратов. При этом ингибирование имеет конкурентный характер, обеспечивая последовательное окисление субстратов в присутствии пероксидазы. Поэтому при совместном окислении аскорбиновой кислоты и ферроцианида калия наблюдается ингибирование пероксидазного окисления ферроцианида аскорбиновой кислотой, в то время как сам ферроцианид калия активирует ее окисление.

61

Глава III

3.3. КИНЕТИКА СОВМЕСТНОГО ОКИСЛЕНИЯ МЕДЛЕННО И БЫСТРО ОКИСЛЯЕМЫХ СУБСТРАТОВ ПЕРОКСИДАЗЫ (АСКОРБИНОВАЯ КИСЛОТА И ГИДРОХИНОН)

Аскорбиновая кислота и гидрохинон в растительных и животных клетках могут участвовать в окислительно-восстановительных реакциях [Гудвин, Мерсер, 1986], выполнять роль антиоксидантов [Кения и др., 1993; Buettner, Moseley, 1992]. Известно, что гидрохинон, как и другие фенолы, участвует в различных метаболических процессах растений, однако его функции и свойства до конца не изучены. Попеременно окисляясь и восстанавливаясь, фенольные соединения служат связующим звеном между водородом дыхательного субстрата и кислородом окружающей среды [Андреева, 1988]. Используя изотопную метку было показано, что основным местом образования фенольных соединений являются молодые ткани растений [Запрометов, 1985]; особенно высокая скорость синтеза фенолов наблюдается при освещении в хлоропластах. В этих органеллах в процессе фотосинтеза с высокой скоростью образуются полифенолы сравнительно простой структуры, которые затем транспортируются в другие компартменты клетки [Андреева, 1988]. Биологическое действие фенольных соединений в клетке обусловлено наличием гидроксильных групп, которые способны к ступенчатой отдаче электронов [Барабай, 1984]. В инфицированных растениях активированный кислород может быть посредником в противоинфекционном действии растительных фенолов, которые способны ингибировать протекание цепных реакций метаболизма, запускаемых свободными радикалами [Аверьянов, Исмаилов, 1986].

Известно, что общим свойством пероксидазных систем являются эффекты активации, т.е. ускорение окисления медленно окисляемого субстрата быстро окисляемым. Поэтому нами был изучен тип взаимного регулирования активности пероксидазы, который реализуется в реакциях совместного окисления медленно и быстро окисляемых субстратов. В качестве медленно окисляемого субстрата была выбрана аскорбиновая кислота, а быстро окисляемого — гидрохинон, для которого величины кса1 были равны 1220-2230 с"' (табл. 7) [Рогожин, Верхотуров, 1999г].

При проведении реакций совместного пероксидазного окисления с участием аскорбиновой кислоты и гидрохинона наблюдалось последовательное окисление субстратов с преимуществен-

62

Пероксидаза в реакциях окисления медленно и быстро окисляемых субстратов

Таблица 7

Величины каталитических констант совместного пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты и гидрохинона

рН Лса|{ГХ)» Kr^nci, к, К Р, Р, п'

С"' мкМ мкМ с' с'

4,0 1220±60 340+20 3,7±0,1 - 25,0±2,2 - 3,1+0,1 5

5,0 2210±210 360+25 6,7±0,2 2,1±0,12 18,0+2,5 3,2±0,2 9,2+0,5 7

5,5 2225+210 340+18 7,8±0,2 1,9+0,11 6,8±0,3 7,1+0,4 23,3+1,2 8

6,0 1910+150 ЗО0±15 1О,7±0,3 1,1+0,11 8,0±0,9 11,5+0,5 34,8±2,5 2

7,0 1740+110 150+10 3,5+0,1 1,1±0,10 3,7±0,1 15,1+0,6 40,7±3,0 2

8,0 1520±100 80±5 0,19±0,02 - 2,9±0,1 - 3,7±0,2 8

ным окислением аскорбиновой кислоты. Гидрохинон ускорял реакции пероксидазного окисления АК, однако при этом сохранялась способность высоких концентраций окисляемого субстрата ингибировать пероксидазу. Особенность совместного окисления субстратов проявлялась в том, что активатор не влиял на Кт, повышая kcat пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты (рис. 13). Это соответствует неконкурентному типу активации (а= 1, Р > 1) при котором субстрат и активатор связываются независимо в активном центре, образуя комплекс в котором ускоряется превращение субстрата [Березин, Клесов, 1976]. Ниже приведена схема 5, которая иллюстрирует суммарный процесс ферментативного окисления.

Таким образом, при совместном окислении АК и гидрохинона осуществлялся упорядоченный процесс окисления субстратов, в котором

63

l/v КГ4, мин М"1

1/AK 1СГ4, М"1

Рис. 13. Зависимости Лайнуивера-Берка для пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты при рН 5,5 в присутствии гидрохинона. Концентрации: пероксидаза — 94 нМ, перекись водорода — 0,64 мМ, АК-2,2-176 мкМ, гидрохинон — 0 (1), 2 (2), 8(3), 12мкМ(4).

Глава III

проявлялось преимущественное окисление медленно окисляемого субстрата. Очередность задавалась тем, что связывание АХ с окисленными формами пероксидазы почти на два порядка лучше, чем гидрохинона. Предварительное связывание АК в активном центре фермента улучшало в 28—420 раз последующее связывание молекул гидрохинона. Однако связавшись гидрохинон не оказывает влияние на связывание второй молекулы АК, что выражал