Биологический каталог




Пероксидаза как компонент антиоксидантной системы живых организмов

Автор В.В.Рогожин

ось в неконку-

схема 5

е+яд-^е,

[(n + 2)S,-E2]

nS, UKM s.-E2-s;—^e-s^ + p,

s, UKs2

e, r^^e, -s, —^->e, -s;-^e+ p, s2nKs3 S2UKa

E| S2 S2 E| S| 1 ^ S2 ^1 ^ S2 E "f~ Pj lks S,UKs2

e2-s2 s2-s,-e2-s;-^Us2-e-s;+p1

1 k6 n'S, Tl K;,

E+P2 [S2-E2-(n'+2)S,]

E, E, и E2 — исходный фермент и его промежуточные соединения 1 и 2 соответственно, S,, S2, Р,, Р2 — аскорбиновая кислота, гидрохинон и продукты их окисления соответственно, S2 - Е, Е - S,, Е, — S,, Е, — S2, Е2 -S,, Е2 — S2, S{ — Е2 — S,, S2 — E — S,, S2 — Ej — St, S2 — E2 — S,, S2 — Sj —E2 —

S[, [(n' + 2) S, - EJ, [S2 - E2 - (n + 2) S,] — комплексы одной, двух, трех, (n + 2) и (n' + 2) молекул субстратов и их полуокисленных форм с натив-ным ферментом и промежуточными соединениями (Е, и Е2). Ksl, Ks2, Кй, Ка — константы диссоциации соответствующих комплексов фермента с

субстратами, К,, Kj2 — константы равновесия, k,, к2, к3, к4, к2, kg, к{ — каталитические константы (к'3 = Р,к3, к'4 = Р2к4).

64

Пероксидаза в реакциях окисления медленно и быстро окисляемых субстратов

рентном типе активирования. Присутствие гидрохинона в активном центре фермента способствовало ускорению окисления молекул АК в 4—41 раз. Особенно этот эффект проявлялся при рН 5,5— 7,0. Оптимум активирования приходился на рН 6—7. Высокие концентрации АК ингибировали фермент как в реакциях индивидуального, так и совместного с гидрохиноном пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты. Причем, если в реакциях индивидуального окисления АК фермент при рН 6,0—7,0 ингибировали 6—9 молекул субстрата (табл. 5), то в реакциях совместного окисления АК и гидрохинона ингибирование пероксидазы было возможно двумя молекулами аскорбиновой кислоты (табл. 7). Поэтому активирование пероксидазы в реакциях индивидуального и совместного пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты высокими концентрациями субстрата и гидрохинона позволило предположить наличие вблизи активного центра фермента регуляторного участка связывание с которым субстратов может повышать или понижать его активность.

3.4. КИНЕТИКА СОВМЕСТНОГО ОКИСЛЕНИЯ ДВУХ БЫСТРО ОКИСЛЯЕМЫХ СУБСТРАТОВ ПЕРОКСИДАЗЫ (О-ДИАНИЗИДИН И ГИДРОХИНОН)

Органические субстраты, связываясь с пероксидазой, могут оказывать влияние на спектр поглощения фермента. По спектральным изменениям субстраты пероксидазы разделяют на два типа [Paul, Ohlsson, 1978]: 1) тип гидрохинона, при добавлении которого происходит несимметричное уширение полосы Соре (403 нм) и уменьшение поглощения в диапазоне 570—630 нм; 2) тип резорцина, при добавлении которого увеличивается поглощение в видимой области спектра, а полоса Соре сдвигается в красную область. Гидрохинон и резорцин конкурируют за место связывания в активном центре пероксидазы. Гидрохинон связывается с пероксидазой с К = 4,6 мМ [Paul, Ohlsson, 1978].

Гемин в пероксидазе недоступен ароматическим соединениям, а при рН, близких к нейтральным, исключается контакт даже для малых ионов из раствора [Савицкий, 1979].

Кинетические схемы реакций пероксидазного окисления медленно окисляемых субстратов пероксидазы (ферроцианида калия [Chance, 1949b], NADH [Лебедева, Угарова, 1997], аскорби-

65

Глава III

новой кислоты [Рогожин, Верхотуров, 1997]) включают стадии комплексообразования субстрата с промежуточными формами фермента.

При окислении быстро окисляемого субстрата о-дианизидина промежуточные радикалы субстратов пероксидазы, образованные в реакции с Е,, восстанавливают образовавшийся Е2 до нативного фермента [Лебедева и др., 1977]. При проведении этой реакции в среде не найдено свободных радикалов [Claiborow, Fridovich, 1979], поэтому высказывалось предположение, в котором допускалось ком-плексообразование Е2 с радикалом полуокисленного субстрата. Предполагалось, что образовавшийся радикал может не выходить в раствор, а оставаться на ферменте, образуя фермент-субстратный комплекс. Лебедевой и Угаровой предположено [Лебедева, Угарова, 1996], что комплекс пероксидазы с полуокисленным о-дианизиди-ном является частицей, эффективно окисляющей другие субстраты пероксидазы при их совместном присутствии, что приводит к активации окисления второго субстрата. Механизм этого явления недостаточно изучен.

Изучив особенности протекания реакций совместного окисления в присутствии медленно и быстро окисляемых субстратов, нами в дальнейшем были изучены реакции совместного окисления быстро окисляемых субстратов (о-дианизидин и гидрохинон).

В реакциях окисления о-дианизидина с гидрохиноном последний определял порядок окисления субстратов [Рогожин, Верхотуров, 1999в]. При этом окисление о-дианизидина не наблюдалось до полного превращения гидрохинона. При высокой концентрации гидрохинон ингибировал реакции индивидуального и совместного с о-дианизидином окисления за счет присоединения двух и более молекул гидрохинона к фермент-субстратному комплексу (рис. 14). Количество молекул гидрохинона, ингибирующих фермент, зависело от рН, что возможно, вызвано уменьшением субстратсвязываюшего участка активного центра фермента при кислых рН. При рН 5-7 в присутствии о-дианизидина скорость пероксидазного окисления гидрохинона возрастала (табл. 8). Активатор не влиял на величину к^, понижая значение Кт для гидрохинона, что характерно для синергической активации (рис. 15). При данном типе активации связывание эффектора с активным центром увеличивает сродство фермента к субстрату.

66

Пероксидаза в реакциях окисления медленно и быстро окисляемых субстратов

л = 3

л=1

1/v, мин мМ

Рис. 14. Линеаризация экспериментальных данных по кинетике пероксидазного окисления гидрохинона в условиях ингибирования ферментативной реакции его избытком. рН 6,0; 0,1 М натрий-фосфатный буфер; пероксидаза — 2 нМ; Н202 — 0,32мМ; гидрохинон— 0,11—1,6мМ.

При рН 4,0 и 4,5 о-дианизидин увеличивал скорость пероксидазного окисления гидрохинона, активируя фермент по смешанному типу, оказывая влияние как на его связывание, так и превра-

67

Глава III

Таблица 8

Величины каталитических констант совместного пероксидазного окисления о-дианизидина и гидрохинона

рН K's, мкМ п а Р Кв, мкМ

4,0 850 ±50 1 2,33 1,37 39±4

4,5 0,31 0,47 27±2

5,0 410 ±35 1 0,16 1,00 47±4

5,5 0,07 1,00 250 ±20

6,0 0,08 ±0,01 2 0,31 1,00 68±5

6,5 0,32 1,00 31+3

7,0 0,06 ±0,01 2 0,42 1,00 28 ±2

щение (табл. 8). По-видимому, гидрохинон и о-дианизидин могут взаимно влиять на процесс связывания в активном центре фермента. При этом предварительное связывание о-дианизидина улучшает последующее связывание гидрохинона, ускоряя процесс его пероксидазного окисления. При окислении гидрохинона в присутствии ферроцианида последний не влиял на его пе-роксидазное окисление. При этом окисление ферроцианида не

происходило до тех пор, пока полностью не окислялся весь гидрохинон. По-видимому это происходило из-за того, что гидрохинон и ферроцианид связываются в активном центре пероксидазы в одном и том же месте. Поэтому предварительное св

страница 18
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70

Скачать книгу "Пероксидаза как компонент антиоксидантной системы живых организмов" (3.56Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.09.2019)