язывание гидрохинона препятствовало последующему связыванию, а следовательно, и окислению ферроцианида.

На основании проведенных исследований гидрохинон можно было отнести к группе быстро окисляемых субстратов пероксидазы, скорость окисления которого возрастает при кислых рН. Поэтому при совместном присутствии в среде гидрохинона и о-дианизидина, после-

1/ГХ, мМ~'

Рис. 15. Зависимости обратных начальных скоростей пероксидазного окисления гидрохинона в присутствии о-дианизидина, мкМ; 1-0, 2-4,3; 3-8,6; 4-17,2; пероксидаза — 0,2 нМ; перекись водорода — 0,32 мМ; рН 5,0.

68

Пероксидаза в реакциях окисления медленно и быстро окисляемых субстратов

дний образует комплекс с ферментом, в котором полуокисленный о-дианизидин способен ускорить окисление гидрохинона в 3—10 раз и это наблюдается до момента его полного окисления. При этом индивидуальное окисление гидрохинона происходит без образования фермент-субстратного комплекса с полуокисленным субстратом.

Таким образом, исследование реакций совместного окисления субстратов позволило выявить корпоративные взаимодействия между субстратами пероксидазы, что проявлялось в упорядоченности механизмов пероксидазного окисления. При этом индивидуальные особенности в строении субстратов определяли порядок их связывания в области активного центра фермента и последующую роль в каталитическом процессе.

Выявлено, что при окислении медленно окисляемых субстратов, таких как аскорбиновая кислота, в механизме действия пероксидазы заложен сложный регуляторный механизм, имеющий биологическое значение. В основе этого механизма лежит способность самих субстратов регулировать процесс окисления. При этом аскорбиновая кислота, являющаяся основным антиоксидан-том растений, может активировать реакции собственного пероксидазного окисления. Предложено, что данный регуляторный механизм обеспечивает выполнение избирательной антиоксидантной функции пероксидазы в растениях. Установлено биологическое значение эффекта активации пероксидазы в реакциях окисления медленно окисляемого субстрата в присутствии быстро окисляемого и ингибирование активности фермента высокими концентрациями субстрата. Выявленные закономерности позволяют понять механизм действия большого количества соединений, используемых в предпосевной обработке семян и обладающих стимулирующим, ретардантным, ингибирующим действием в отдельности, а также в различных сочетаниях. Пероксидаза входит в состав комплекса ферментов, катализирующих окисление различных соединений, используемых в аэробных метаболических процессах, интенсивность которых возрастает в процессе набухания и прорастания семян. До сих пор являются спорными вопросы относительно эффектов активирования всхожести семян низкими концентрациями соединений и механизмы понижения всхожести семян высокими концентрациями веществ. На основании полученных данных мы предложили механизм участия пероксидазы в этих процессах. Поскольку фермент является показателем проте-

69

Глава III

кания аэробных метаболических процессов в семенах, активность фермента увеличивается при прорастании и можно считать, что понижение активности пероксидазы служит критерием углубления состояния покоя семян. Поэтому аскорбиновая кислота и гидрохинон в высоких концентрациях понижают активность пероксидазы, могут способствовать переключению аэробных метаболических процессов на анаэробные, что будет проявляться в углублении покоя семян и понижения всхожести. Низкие концентрации субстратов пероксидазы при их совместном присутствии, напротив, способны активировать фермент, увеличивая скорость протекания аэробных метаболических процессов, обеспечивая переход семян из покоя в активное состояние, увеличивая их энергию прорастания и всхожесть. Предложено, что при совместном присутствии в среде гидрохинона и о-дианизидина, последний образует комплекс с ферментом, в котором полуокисленный о-дианизидин способен ускорить окисление гидрохинона в 3—10 раз и это проявляется до его полного окисления. Индивидуальное окисление гидрохинона происходит без образования фермент-субстратного комплекса с полуокисленным субстратом. Данный механизм может быть использован в растениях для окисления различных фенолов и, возможно, лигнина.

3.5. ВЛИЯНИЕ ИНДОЛИЛ-З-УКСУСНОЙ кислоты НА РЕАКЦИИ ПЕРОКСИДАЗНОГО ОКИСЛЕНИЯ МЕДЛЕННО И БЫСТРО ОКИСЛЯЕМЫХ СУБСТРАТОВ

Интерес к механизму действия пероксидазы вызван еще и тем, что фермент способен катализировать окисление органических соединений не только перекисью водорода, но и кислородом воздуха [Угарова и др., 1981]. К оксидазным субстратам пероксидазы относится индолил-3-уксусная кислота (ИУК), однако ее роль в регулировании реакций пероксидазного окисления не изучена [Savitsky et al., 1999; Gazarian et al., 1998; Gazarian et al., 1999].

Пероксидаза катализирует окисление индолил-3-уксусной кислоты как в присутствии, так и в отсутствие перекиси водорода [Metodiewa et al., 1992; Park, Park, 1987; Pieres, 1992]. В процессе оксидазного окисления ИУК образуются супероксид анион-радикал и катион-радикал ИУК, последний в кислой среде декар-боксилируется, превращаясь в радикал скатола [Gazarian, 1998; Савицкий и др., 1998]. Предложено, что пероксидаза способна

70

Пероксидаза в реакциях окисления медленно и быстро окисляемых субстратов

одновременно связывать как перекись скатола, так и молекулу ИУК. Высказывается предположение, что на поверхности белка существует центр специфического связывания ауксина, отличающийся от активного центра, расщепляющего перекись водорода или органическую гидроперекись [Савицкий и др., 1998]. С помощью компьютерных методов показано, что пероксидазы растений и ауксин-связывающие белки содержат участки сходной структуры. При этом эти участки формируют основную часть дистального домена пероксидаз растений, и один из них непосредственно соответствует последовательности, координирующей гем с дистальной стороны активного центра [Савицкий и др., 1998]. По данным антигенного картирования пероксидазы хрена установлено, что в состав активного центра фермента входят несколько функционально важных аминокислотных остатков: Arg 38, Phe 142 и 143, которые формируют канал доступа ароматических субстратов к активному центру пероксидазы хрена [Ам-мосова и др., 1997]. Установлен молекулярный механизм расщепления перекиси водорода в активном центре пероксидаз растений [Schuller et al, 1996;.Gajhede et al, 1996]. Показано, что в катализе фермента участвуют железо (III) протопорфирина IX и два дис-тальных аминокислотных остатка — His 42 и Arg 38. Однако до сих пор существуют сложности в предсказании субстратной специфичности пероксидазы хрена, недостаточно изучены механизмы пероксидазного окисления быстро и медленно окисляемых органических субстратов (Ьермента. Поэтому нами было изучено участие индолил-3-уксусной кислоты в механизме пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты, а также, по возможности, мы постарались раскрыть основные закономерности этого каталитического процесса.

3.5.1. ВЛИЯНИЕ ИНДОЛИЛ-З-УКСУСНОЙ кислоты НА РЕАКЦИИ