следует выделить антиоксиданты — соединения, способные подавлять образование свободных радикалов, ингибировать ПОЛ. Таким образом, между пероксидазой и антиоксидантами должна наблюдаться взаимная зависимость, которая, к сожалению, недостаточно изучена, как и роль пероксидазы в этих процессах.

В живых организмах существует физиологически нормальный уровень свободнорадикальных процессов и перекисного окисления липидов, необходимый для регулирования липидного состава, проницаемости мембран, и ряда биосинтетических процессов (Бурлакова и др., 1991). В генерировании свободных радикалов в биогенных системах может принимать участие и пероксидаза. Однако, несмотря на многолетние исследования фермента, полностью раскрыть его роль в биогенных системах пока не удается. Это во многом связано с тем, что слабо изученным является механизм действия фермента и, в особенности, устройство активного центра пероксидазы. Поэтому в этой работе мы постарались раскрыть механизм действия пероксидазы, а также роль фермента в составе антиоксидантной системы живых организмов, обобщая как литературные, так и собственные исследования.

Автор выражает искреннюю благодарность докторам химических наук H.H. Угаровой и Г.Д. Кутузовой (Московский государственный университет), а также сотрудникам лаборатории исследования биологически активных веществ ЯГСХА: T.T. Курилюк, В.В. Верхотурову, ТВ. Рогожиной и O.B. Соколовой.

ГЛАВА I

ГЕМСОДЕРЖАЩИЕ БЕЛКИ, КАТАЛИЗИРУЮЩИЕ ПЕРОКСИДАЗНЫЕ РЕАКЦИИ

1.1. СТРУКТУРА И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ГЕМСОДЕРЖАЩИХ БЕЛКОВ

Гембелки представляют собой класс белков и ферментов, главной функциональной частью которых является железосодержащий протопорферин IX. Эти белки обладают различными функциями и механизмом действия [Ком, 1978]. Одни из них способны обратимо связывать кислород, транспортируя его к различным органам и тканям организма (гемоглобин), другие запасают кислород в связанном виде (миоглобин). Гембелки катализируют окисление или переокисление различных соединений кислородом (цитохром Р450 и пероксидазы), участвуют в процессах переноса электронов (цитохромы вис), катализируют разложение гидроперекисей (каталаза), восстановление кислорода до воды (цитохром с оксидаза). Приставки геми- и гемо- происходят от названий железопорфириновых группировок, при этом железо (II) порфириновый комплекс называют гемом, а железо (III) пор-фирин — гемином.

Различные гемопротеины отличаются как строением полипептидных цепей, так и структурой порфириновой части [Falk, 1967; Degli, 1989; Andersson, Dawson, 1991; Austin et al., 1993]. Свойства re-мопротеинов существенно зависят от структуры входящих в их состав порфиринов, аксиальных лигандов, состояния окисления центрального атома и природы белкового окружения [Евстигнеева и др., 1995; Степуро и др., 1997; Моисеева, Постникова, 2001]. Полную информацию о строении и механизме действия гембелков можно получить, если использовать результаты целого комплекса различных методов исследования: рентгеноструктурного анализа, электронной спектроскопии в видимой и УФ-области, спектров КД и ДОВ, ЯМР- и ЭПР- спектроскопии, кинетических и биохимических характеристик, компьютерные методы и др. [Bearden, Dunham,

7

Глава!

1970; Kitagawa, Ozaki, 1987; Armstrong, 1988; Austin et al., 1993; Henry et al., 1993; Cupane et al., 1995]. Мы провели сравнительный анализ строения активных центров и механизм действия гемоглобина, миоглобина, каталазы, цитохром с пероксидазы и цитохрома с, являющихся родственными пероксидазе гембелками. Сравнение первичной аминокислотной последовательности, а также рен-тгеноструктурные данные показывают наличие у этих гембелков схожего с пероксидазой лигандного окружения в области железа гема как с проксимальной, так и с диетальной стороны [Welinder, Mazza, 1977; Долманова, Угарова, 1980]: гем располагается в складке, образованной гидрофобными остатками полипептидной цепи, а его пропионовокислые остатки направлены к поверхности белковой глобулы и участвуют главным образом в стабилизации третичной структуры и правильной ориентации гема на белке за счет образования водородных связей с боковыми аминокислотными остатками. Анализ литературы дает возможность предположить, что такое расположение гема типично для большинства гембелков.

Вследствие сходства в строении активных центров гембелки могут катализировать некоторые пероксидазные реакции [Keilin, Hartree, 1955]. Так известно, что мономерная субъединица каталазы способна участвовать в реакциях окисления субстратов перекисью водорода, утрачивая при этом каталазную активность. Сама же каталаза, т.е. ее тетрамер, может проявлять только умеренную пероксидазную активность. Гемоглобин и миоглобин в реакции с перекисью водорода образуют промежуточные соединения аналогичные, как было показано в работах [Keilin, Hartree, 1955; Пратт, 1978], промежуточным соединениям пероксидазы. Поэтому они могут катализировать пероксидазные реакции, однако скорость этих реакций значительно медленнее, чем у пероксидазы [Keilin, Hartree, 1955]. Причем метмиоглобин в перок-сидазных реакциях окисления ABTS был в 2,7 раза активнее, чем метгемоглобин [Метелица и др., 2001]. Значения каталитических констант для метмиоглобина (0,021 с-1) и метгемоглобина (0,0105 с-1) намного уступали их величинам для пероксидаз [Метелица, 1984], но были близки с каталитическими константами окисления о-фенилендиамина с участием гемина (0,013 с-1) или ТМБ с участием гемина (0,017 с-1) и метгемальбумина (0,016 с-1). По каталитической активности в пероксидазном окислении аминов предлагается в следующем порядке расположить гемсодер-жащие биокатализаторы [Метелица и др., 2001]: пероксидазы »

8

Гемсодержащие белки, катализирующие пероксидазные реакции

ферритин > > метмиоглобин > метгемоглобин > метгемальбу-мин > гемин. В ходе каталитического процесса отмечалась частичная деструкция биокатализатора радикалами, образующимися при разложении Н202 [Метелица, 1984; Еремин и др., 1996; Заводник, Лапшина, 1996]. В работе [Степуро и др., 1997] показано, что кислородные свободные радикалы и пероксид водорода вызывают повреждение белковой глобулы гемоглобина, высвобождение гемина, ионов Fe(III) и расщепление порфиринового кольца. Деструкция гембелков, возможно, вызвана отсутствием поверхностных систем защиты белковых глобул, которые выполняют углеводы у пероксидазы, покрывающие апобелок снаружи.

Структуры активных центров гемоглобина, миоглобина и каталазы являются более высокоорганизованными по сравнению с пероксидазой, т.к. их активные центры предназначены в основном для выполнения специфических функций в организме человека [Пратт, 1978]. Однако, несмотря на высокую структурную организацию, эти гемсодержащие белки сохранили способность участвовать в реакциях окисления, что, возможно, позволяет в ряде случаев использовать специализированные ферментные системы в окислительных реакциях, реализуемых при включении механизмов саморазрушения клеток, т.е. в механизмах апоп-тоза, участвуя в активизации механизмов перекисного окисления липидов в б