ПЕРОКСИДАЗНОГО ОКИСЛЕНИЯ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ

Исследование влияния ИУК на реакции пероксидазного окисления АК позволило установить [Рогожин, Рогожина, 2002], что ауксин ингибирует фермент по конкурентному типу при связывании в активном центре (Ьермента одной молекулы аскорбиновой кислоты (рис. 16, а). Тогда как в реакциях пероксидазного окисления АК с участием двух и более молекул субстрата ИУК проявляла неконкурентный характер ингибирования (рис. 16, б).

71

Глава III

4

3 2

-0,2

-0,1 " 0,1 0,2

а

1/АК, мкМ"

0,3 -0,02

г-1

0,02 0,04 1/АК, мкмМ"1

Рис. 16. Зависимости обратных начальных скоростей пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты при рН 5,0 (а) и 7,0 (б) от ее концентрации при различных концентрациях индолил-3-уксусной кислоты, мкМ: 1-0, 2-5, 3-10,4-15. Концентрации: а) пероксидаза — 99 нМ, аскорбиновая кислота — 3,65—9,12 мкМ; б) пероксидаза — 142 нМ, аскорбиновая кислота — 22,8—91,2 мкМ.

Связывание ИУК с пероксидазой в реакциях конкурентного ингибирования достаточно прочное и составляет 5,4—20,5 мкМ, что соизмеримо с величинами констант связывания аскорбиновой кислоты и о-дианизидина. В реакциях неконкурентного ингибирования ИУК связывается с пероксидазой в 3,2—10,2 раза лучше, чем связывание второй молекулы АК. При этом величины констант ингибирования в реакциях неконкурентного ингибирования при рН 4,5—7,0 для ИУК равны 27,3—34,6 мкМ.

В активном центре пероксидазы имеется несколько функциональных групп, принимающих участие в ферментативном катализе. Однако природа этих групп пока не установлена [Андреева, 1988]. Предполагается, что в области связывания ароматических субстратов могут располагаться аминокислотные остатки: Arg 38, Phe 142 и 143 [Аммосова и др., 1997]. При этом место связывания ИУК может находиться в структуре субдомена ауксин-связываю-щего участка вблизи Trp 117, который может принимать участие в связывании ИУК пероксидазами растений [Савицкий и др., 1998].

. Исследование зависимостей lgkcat/Km от рН для пероксидазного окисления с участием одной или двух молекул аскорбиновой кислоты не позволяет определить природу функциональных групп активного центра, принимающих участие в катализе АК (рис. 17). Аналогичная закономерность отмечается и на кривых lgK от рН для констант конкурентного и неконкурентного ингибирования пероксидазы ИУК (рис. 18). Причем величины констант конкурентного ингибирования практически не зависели от

72

Пероксидаза в реакциях окисления медленно и быстро окисляемых субстратов

Рис. 17. рН-зависимости lg (kMt/Km) для реакций пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты при связывании с ферментом одной (1) и двух молекул аскорбиновой кислоты (2).

Рис. 18. Зависимости констант конкурентного (1) и неконкурентного (2) ингибирования пероксидазы индолил-3-уксус-ной кислотой в реакциях пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты отрН.

рН. Тогда как значения констант неконкурентного ингибирования понижались в диапазоне рН 5—6 с возрастанием в кислой и нейтральной областях рН.

Таким образом, используя ИУК, можно предположить место локализации участка связывания молекул аскорбиновой кислоты в активном центре пероксидазы. По-видимому таким участком является дистальная область активного центра фермента. Связывание ИУК в этой области при низких концентрациях субстрата создает конкуренцию за участок связывания, проявляемую в реакциях пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты, когда в активном центре фермента связывается, по крайней мере, одна молекула субстрата. При связывании двух и более молекул аскорбиновой кислоты с пероксидазой наблюдается ускорение реакции окисления аскорбиновой кислоты, что, возможно, вызвано кооперативными взаимодействиями между участками связывания этих двух молекул субстрата.

3.5.2. ВЛИЯНИЕ ИНДОЛИЛ-З-УКСУСНОЙ КИСЛОТЫ НА РЕАКЦИИ ПЕРОКСИДАЗНОГО ОКИСЛЕНИЯ О-ДИАНИЗИДИНА И ГИДРОХИНОНА

Известно, что окисление ИУК пероксидазой протекает через образование тройного комплекса фермент-ИУК-кислород. Исследования механизма окисления ИУК пероксидазой растений показали, что на поверхности белковой глобулы должен располагаться участок связывания ауксина [Metodiewa et al, 1992; Park, Park, 1987; Pieres et al, 1992], который может находиться в составе

73

Глава III

дистального домена фермента [Савицкий и др., 1998]. При этом считается, что активную роль в катализе пероксидазы принимает участие остаток Тгр-117, удаленный на 8—9 А от атомов азота порфиринового цикла, т.е. находящегося в зоне туннелирования электронов. При этом субдомен, включающий структурно сходные участки в дистальном домене пероксидазы, формируется в направлении от активного центра к поверхности дистального домена противоположной входу в активный центр.

Таким образом предполагается, что центр связывания ИУК может располагаться вдали от активного центра пероксидазы [Савицкий и др., 1998]. Причем оксидазное окисление ИУК может возрастать в присутствии гидрофобных аминокислот, тогда как полярные аминокислоты почти не оказывают влияние на каталитический процесс оксидазного окисления ауксина. Установлена прямая корреляция между гидрофобностью аминокислот и степенью их влияния на скорость окисления ИУК [Park, Park, 1987]. Однако в литературе отсутствуют данные по влиянию ИУК на пероксидазное окисление различных неорганических и органических субстратов, катализируемое пероксидазой растений. Возможно, что проведение таких исследований позволило бы определить расположение активного центра фермента на поверхности белковой глобулы, установить участки индивидуального связывания ИУК и исследуемых субстратов на ферменте.

Поэтому проведенное нами изучение реакций совместного пероксидазного окисления о-дианизидина, гидрохинона и ферроцианида калия в присутствии индолил-З-уксусной кислоты позволило установить следующие закономерности [Рогожина, Рогожин, 2003]. Ауксин ингибирует пероксидазу в реакции окисления о-дианизидина по конкурентному типу (рис. 19), тогда как в реакциях окисления гидрохинона при кислых значениях рН проявлялся неконкурентный характер ингибирования (рис. 20), переходящий при рН > 6,5 в смешанный тип (рис. 21). Присутствие ауксина не влияло на пероксидазное окисление ферроцианида калия.

Конкурентный тип ингибирования реакции пероксидазного окисления о-дианизидина ИУК позволяет предположить, что о-дианизидин и индолил-3-уксусная кислота связываются в одном и том же месте активного центра фермента. При этом связывание ИУК препятствует как связыванию, так и превращению о-дианизидина. Тогда как по отношению к гидрохинону тип ингибирования несколько другой. ИУК и гидрохинон связываются в различ-

74

Пероксидаза в реакциях окисления медленно и быстро окисляемых субстратов

1/ОДН, мМ4

Рис. 19. Зависимость начальной скорости пероксидазного окисления о-диани-зидина от его концентрации в двойных обратных координатах при различных концентрациях индолил-3-уксусной кислоты, мкМ: 1-0, 2-10, 3-20, 4-30; пероксидаза — 0,56 нМ; перекись водорода— 0,64 мМ; 0,1 М натрий-фосфатный буфер, рН 7.

40 • 1/v,