мин мкМ 4

30 ¦

20- '

10-

2^ 2 4 6 ¦ 1 1 i 8 10

1/ГХ.мМ""1

Рис. 20. Зависимость начальной скорости пероксидазного окисления гидрохинона от его концентрации в координатах Лай-нуивера-Берка при различных концентрациях индолил-3-уксусной кислоты, мкМ: 1-0,2-20,3-40,4-60; пероксицаза — 4,0 нМ; перекись водорода — 0,64 мМ; 0,1 М натрий-ацетатный буфер, рН 5.

40- I/v, мин мМ 1 ^4

зо-

¦ ^3

20 -

I-'-1-Г-ТТ —1—fill—1—•¦¦ 1 .—*-1 -1—г—1

ных местах активного центра, однако, если индолил-3-уксусная кислота связывалась на поверхности фермента, то дальнейшее превращение гидрохинона становится невозможным. Это наблюдается вследствие удаленности мест связывания эффектора и субстрата или в результате конформационных изменений глобулы фермента при связывании ингибитора. Причем при рН 4,5—6,5 тип ингибирования неконкурентный, однако при увеличении рН он меняется и становится смешанным. При этом величина а увеличивалась (ос> 1), а р уменьшалась (р < 1). Изменение этих постоянных характеризует ухудшение связывания субстрата в 2,8— 4,2 раза, т.е. при наличии ИУК происходило понижение сродства гидрохинона к активному центру фермента. Однако, если все-таки гидрохинон связался в активном центре, то дальнейшее его превра-

-4

6

1/ГХ, мМ

10

Рис. 21. Зависимость начальной скорости пероксидазного окисления гидрохинона от его концентрации в двойных обратных координатах при различных концентрациях ин-долил-3-уксусной кислоты, мкМ: 1-0,2-20,3-40,4-80; пероксидаза — 4,0 нМ; перекись водорода — 0,64 мМ; 0,1 М натрий-фосфатный буфер, рН 7,5.

75

Глава Л I

щение ухудшалось в 1,7—5,3 раза. Связывание ИУК с пероксидазой зависело от рН среды. Так в реакциях пероксидазного окисления о-дианизидина величина К при рН 4,5—7,0 изменялась в диапазоне от 9,6 до 0,72 мкМ, т.е. с возрастанием рН сродство ингибитора к ферменту повышалось в 13,3 раза. Тогда как в реакциях окисления гидрохинона величина К, в этом же диапазоне рН изменялась от 113 до 17 мкМ, т.е. константа ингибирования понижалась в 6,6 раза. При этом эффективность связывания ИУК с пероксидазой, например, при рН 4,5 и 7,0 лучше связывания о-дианизидина в 4,2 и 20,8 раз, а гидрохинона — 5,8 и 8,8 раз соответственно. В реакциях пероксидазного окисления о-дианизидина связывание ИУК с ферментом при рН 4,5 и 7,0 было в 11,8 и 23,6 раза соответственно эффективнее, чем в реакциях окисления гидрохинона. По-видимому на сродство ингибитора к ферменту оказывает влияние природа субстрата. Причем субстраты, имеющие близкую с ИУК полярность, значительно повышали эффективность связывание ингибитора с пероксидазой. Аналогичные зависимости были получены при изучении связывания ИУК в присутствии гидрофобных и полярных аминокислот [Park, Park, 1987]. Причем увеличение гидрофобности аминокислоты повышало сродство ауксина к ферменту. Поэтому преимущественным местом связывания ИУК и о-дианизидина в активном центре пероксидазы, по-видимому, должна быть гидрофобная область [Савицкий и др., 1998]. Тогда как для гидрохинона местом связывания является область на поверхности фермента, содержащая большее число полярных или заряженных аминокислотных остатков [Лебедева, Угарова, 1996]. Подтверждением различных мест связывания о-дианизидина и гидрохинона в активном центре пероксидазы служат данные по совместному перок-сидазному окислению этих субстратов. На основании полученных данных можно предположить, что ИУК являясь оксидазным субстратом пероксидазы, способна связываться в составе дистального домена активного центра фермента, ингибируя протекание пе-роксидазных реакций. При этом пероксидаза будет выполнять роль высокоспецифичной оксигеназы ауксина.

Из рН-зависимостей lgkcat/Km для о-дианизидина и гидрохинона видно, что формы кривых имеют сложную зависимость, затрудняющие определение природы ионогенных групп нативного фермента, принимающих участие в катализе этих субстратов (рис. 22). По-видимому, ионогенные группы, принимающие участие в каталитическом процессе пероксидазы, находятся в ок-

76

Пероксидаза в реакциях окисления медленно и быстро окисляемых субстратов

4 5 6 7 8 рН

Рис. 22. рН-Зависимости lg (км|/ Кга) для реакций пероксидазного окисления о-дианизидина (1) и гидрохинона (2).

ружении гидрофобных аминокислотных остатков, что проявляется в затруднении определения рКа этих функциональных групп на рН-зави-симостях каталитических констант реакций пероксидазного окисления о-дианизидина и гидрохинона, поскольку сами субстраты содержат функциональные группы с высокими значениями рКа и в исследованном диапазоне рН могут находиться только в протонированной форме, например, рКа групп гидрохинона 9,85 и 11,4 [Досон и др., 1991], а о-дианизидина - 3,6 и 4,7 [Muller, Ottolenghi, 1966]. Данные утверждения подтверждаются исследованиями по антигенному картированию пероксидазы хрена [Аммосова и др., 1997]. Выявленные эпитопы содержали несколько функционально важных остатков: His-42 и Arg-38, входящих в активный центр пероксидазы, вблизи которых находятся гидрофобные аминокислотные остатки (Phe-142 и 143), формирующие канал доступа ароматических субстратов к активному центру фермента.

Из рН-зависимостей lgK., в реакциях окисления о-дианизидина определяются две ионогенные группы с рКа 4,7 и 6,5 (рис. 23, кривая 1), а гидрохинона — одна ионогенная группа с рКа 6,8 (рис. 23, кривая 2). Проявление этих групп, по-видимому, вызвано наличием в составе молекулы индолил-3-уксусной кислоты карбоксильной группы с рКа 4,5 [Досон и др., 1991] протонирование и депротонирование которой позволяет выявить две ионогенные функциональные группы активного центра пероксидазы, принимающие участие в пероксидазном окислении о-дианизидина и одну — в окислении гидрохинона.

3,5 п lgK

-4,5

-5,5

я э о / рН

Рис. 23. рН-Зависимости константы ингибирования реакций пероксидазного окисления о-дианизидина (1) и гидрохинона (2) индолил-3-уксусной кислотой. Кривые являются теоретически-ми для рК (ОДН+иук) = 4,7, К = = 23,8 мкМ; рКв (ОДН + иуК) = 6,5,

= 6,8, К

В (ГХ + ИУК)

В (lim)

104 мкМ

77

Глава III

Выявленные эффекты влияния ИУК на пероксидазное окисление аскорбиновой кислоты, гидрохинона и о-дианизидина, катализируемое пероксидазой, имеют важное биологическое значение. ИУК может регулировать пероксидазное окисление медленно окисляемого субстрата, имея специфичный участок связывания в составе дистального домена активного центра пероксидазы. По-видимому, избирательность типов ингибирования пероксидазы ИУК обусловлена специализированностью ауксина служить оксидазным субстратом фермента. При этом ИУК может изменять направленность реакций пероксидазы с одного типа на другой, меняя специфичность фермента с пероксидазного на оксидазный, превращая пероксидазу в высокоспецифичную оксигеназу, генерирующую свободные радикалы необходимость в которых может возникать у растений в процессе развития. При этом ИУК может выполнять роль «триггера» в реакциях окисления, катализи