ления АК в присутствии о-дианизидина может превышать скорость индивидуального окисления аскорбиновой кислоты более, чем на два порядка, а о-дианизидина— в 1,5—2,0 раза.

Таким образом, трудно окисляемый субстрат, каким является аскорбиновая кислота, по-видимому, эффективнее окисляется радикалами быстро окисляемого субстрата о-дианизидина, чем соединениями Е, и Е2 пероксидазы. При этом на кривых рН-зависимо-стях lgkcat реакций как индивидуального, так и совместного с о-диани-зидином окисления аскорбиновой кислоты проявлялась ионогенная группа с рКа — 6,5 (рис. 26).

На основании исследования характера ингибирования пероксидазы ди-гоксином и кверцетином в реакциях окисления о-дианизидина можно высказать предположения о строении активного центра фермента. Оба ингибитора могут связываться в актив-

82

Рис. 26. Зависимость логарифма каталитических констант индивидуального пероксидазного окисления о-дианидизина (1), аскорбиновой кислоты(2) и совместного окисления аскорбиновой кислоты и о-дианизидина (3) от рН.

Пероксидаза в реакциях окисления медленно и быстро окисляемых субстратов

ном центре пероксидазы, оказывая влияние на последующее течение каталитического процесса. Связывание дигоксина возможно только с фермент-субстратным комплексом, что проявляется в последующем замедлении реакции окисления о-дианизидина. Тогда как кверцетин может связываться со свободным ферментом, причем предварительное связывание кверцетина в области активного центра пероксидазы ухудшает последующее связывание и превращение о-дианизидина. Природа ингибирования пероксидазных реакций окисления о-дианизидина позволяет высказать предположение о размерах субстратсвязывающей площадки в области активного центра фермента.

Взаимное влияние субстратов, а также регуляторное действие ингибиторов и активаторов возможно если активный центр пероксидазы представлен в виде протяженной субстратсвязывающей области, состоящей из нескольких участков, где могут одновременно связываться как субстраты, так и эффекторы. Причем связывание последних проявляется в регулировании активности пероксидазы.

Таким образом, установлена регуляторная роль антиоксидантов в пероксидазном окислении быстро окисляемых субстратов, катализируемых пероксидазой. Выявленные закономерности позволяют предположить, что увеличение содержания антиоксидантов в исследуемом биообъекте может ингибировать перокси-дазу, тогда как возрастание содержания пероксидазы будет способствовать быстрому их окислению.

3.7. ФЕНОТИАЗИНЫ (ХЛОРПРОМАЗИН, ТРИФТАЗИН, ТИОПРОПЕРАЗИН) В ПЕРОКСИДАЗНЫХ РЕАКЦИЯХ

Производные фенотиазина представляют собой конденсированную гетероциклическую систему, состоящую из шестичлен-ного гетероцикла тиазина и двух ядер бензола [Беликов, 1985]:

83

Глава III

Установлено, что в зависимости от характера заместителя у атома азота в положениях 2 и 10, производные фенотиазина могут обладать противогистаминным, холинолитическим, седативным и нейролептическим действием.

Ультрафиолетовые спектры 10-алкилпроизводных фенотиазина в этаноле имеют по два максимума поглощения в области 290—330 нм; у 10-ацилпроизводных наблюдается гипсохромное смещение обоих максимумов. ИК-спектры в области 4000-250 см-1 насчитывают по 20—25 полос поглощения [Азамасцев, Яскина, 1975].

Производные фенотиазина легко окисляются в том числе и кислородом воздуха, а продукты их окисления имеют окраску. Реакции эти в большинстве своем мало специфичны и почти не изучены. Предполагается, что окрашенные вещества образуются за счет окисления атома серы, а также за счет окисления ядра фенотиазина в положениях 3 и 6. В зависимости от характера окислителя и условий выполнения реакции образуется смесь продуктов окисления, например, 9-8-оксид и 9,9-диоксид [Беликов, 1985].

Пероксидазное окисление хлорпромазина, трифтазина и ти-опроперазина недостаточно изучено. Не исключено, что исследование реакций пероксидазного окисления этих фенотиазинов позволит разобраться в динамике их превращения в живых организмах и раскрыть особенности фармакологического действия препаратов.

3.7.1. ПЕРОКСИДАЗНЫЕ РЕАКЦИИ ИНДИВИДУАЛЬНОГО И СОВМЕСТНОГО ОКИСЛЕНИЯ ФЕНОТИАЗИНОВ

Спектр хлорпромазина в 0,1 М Na-фосфатном буфере при рН 7,0 имеет три выраженных максимума поглощения в УФ-об-ласти (215, 254 и 305 нм) (рис. 27) [Рогожин, Верхотуров, 1998а]. Для максимума поглощения при 254 нм нами определен молярный коэффициент поглощения (29 мМ-1 см-1), что соответствует литературным данным [Азамасцев, Яскина, 1975]. В процессе пероксидазного окисления в спектре поглощения хлорпромазина появляются три максимума поглощения: при 220, 275 и 526 нм (рис. 27). Известно, что в процессе окисления хлорпромазина появляются продукты окисления, имеющие нестабильную розовую окраску [Беликов, 1985]. Аналогичные изменения наблюдали и мы при проведении реакции пероксидазного окисления хлорпромазина, катализируемого пероксидазой хрена. В отсутствие

84

Пероксидаза в реакциях окисления медленно и быстро окисляемых субстратов

^^^^^^^^^^^^ Iг

550 500 350 300 250

X, нм

Рис. 27. Спектр поглощения хлорпромазина и продуктов его пероксидазного окисления в 0,1 М Na-ацетатном буфере, рН 4,5. Время реакции, мин: 1-0; 2-2; 3-4; 4-6; 5-18. Концентрации: хлорпромазин — 17,2 мкМ, пероксидаза — 20 нм; перекись водорода — 0,64 мМ.

фермента реакция не наблюдалась. В течение первых минут проведения реакции спектр хлорпромазина изменялся — максимум поглощения при 254 нм полностью исчезал. Поэтому определение скорости пероксидазного окисления хлорпромазина в присутствии пероксидазы хрена проводили, регистрируя уменьшение поглощения светопоглощения при 254 нм.

Исследование индивидуальных реакций окисления хлорпромазина позволило отнести его к группе медленно окисляемых субстратов пероксидазы (kcat измеренная в диапазоне рН 4,5—7,0 понижалась от 114 до 3,5 с-1)- При этом связывание хлорпромазина с пероксидазой зависело от рН и составляло 85— 270 мкМ. На кривой рН-зависимости lgk^ и lg(kcat/Km) определялась ионогенная группа с рКа 6,0 (рис. 28, а и б, кривые 1, Г). В щелочной области рН связывание хлорпромазина с ферментом в 2,5—3,0 раза лучше, чем в кислой среде. Предложено, что окисление хлорпромазина протекает по одноэлектронному механиз-

85

Глава HI

Рис. 28. рН-Зависимости lgk.ai (а) и lg (kcal/Km) (б) для реакций пероксидазного окисления аминазина (1, Г) и ферроцианида калия (2, 2'). Пунктирная кривая рассчитана с использованием значений рКа = 6,0, (k. ,/Km)lim = 4,75 105 M-'ceic1.

му, характерному для пероксидазного окисления неорганических ионов. В реакции совместного окисления хлорпромазина и ферроцианида калия хлорпромазин ускорял пероксидазное окисление ферроцианида калия, увеличивая сродство субстрата к ферменту, но не влияя на величину каталитической константы в интервале рН 5-7 (рис. 29). На кривых рН-зависимо-стей lgKa и lgcc определялись ионогенные группы с рКа — 5,75 и 6,19 соответственно, депротонирование которых улучшало связывание хлорпромазина с пероксидазой и увеличивало сродство фермента