-дианизидина ПО антикон-8,6 (2), 17,2 (3), 25,8 мкМ (4); концен- курентному типу (рис. 37). При трация пероксидазы 0,14 нМ;Н202- ЭТОМ ингибитор связывался С

том. Связывание строфантина G в активном центре фермента в реакциях окисления фенотиазинов и о-дианизидина несколько различалось. При кислых значениях рН строфантин G эффективнее связывался с пероксидазой в реакциях пероксидазного окисления тиопроперазина, тогда как при окислении трифтазина, хлорпромазина и о-дианизидина его связывание с ферментом хуже в 2,4, 3,1 и 5,9 раз соответственно. При рН > 6,0 резко понижалась скорость каталитического процесса, при этом отмечалось улучшение в связывании эффектора в реакциях окисления хлорпромазина в 3, трифтазина — в 1,4, о-дианизидина — в 1,5 раза, с ухудшением связывания строфантина G при окислении тиопроперазина в 2,8 раза. В реакциях ингибирования пероксидазного окисления о-дианизидина строфантином G ни одна из групп активного центра фермента себя не проявила, что, возможно, объясняется различным расположением строфантина G в активном центре фермента при осуществлении реакций пероксидазного окисления фенотиазинов и о-дианизидина.

Исследования механизмов пероксидазного окисления фенотиазинов позволило высказать предположения о возможных сроках нахождения фенотиазинов в организме человека, а также дать предположительную оценку эффективности их действия. Среди изученных фенотиазинов выраженное седативное действие трифтазина можно объяснить за счет того, что поскольку он в присут-

сом, а не со свободным фермен-

94

Пероксидаза в реакциях окисления медленно и быстро окисляемых субстратов

ствии быстро окисляемого субстрата не окисляется пероксидазой, то он должен дольше сохранять свое функциональное действие. Быстрее всех в организме может окисляться аминазин и его действие должно быть за счет этого непродолжительным. Кроме этого обосновано действие фенотиазинов в присутствии строфантина G при их совместном использовании. Поскольку строфантин G ускоряет окисление тиопроперазина, то при их совместном введении пероксидазное окисление тиопроперазина будет возрастать, что приведет к образованию различных продуктов его окисления и к быстрой потере фармакологического действия. Тогда как пероксидазное окисление трифтазина и аминазина в присутствии строфантина G будет замедляться, обеспечивая таким образом пролонгированность действия вводимых препаратов.

3.8. УЧАСТИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНО АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ В ПЕРОКСИДАЗНЫХ РЕАКЦИЯХ

К группе функционально активных веществ относятся производные бензола (салицилат натрия, норадреналин и викасол), участие которых в пероксидазных реакциях не исследовано. Хотя известно, что салицилат натрия и пероксидаза участвуют в повышении общей резистентности растений [Raskin, 1992]. Биосинтез салициловой кислоты осуществляется специализированной системой приобретенной устойчивости [Metraux et al, 1990, Cao et al, 1994]. В механизме индивидуальной устойчивости при инфекционном поражении растений салициловая кислота индуцирует синтез PR-белков (pathogenesis related proteins), которые могут выполнять защитную функцию как при инфекционном поражении растений, так и при стрессах различной природы [Tuan-Hua, Martin, 1980г Ильинская и др., 1991]. Так, например, в проростках пшеницы под действием салициловой кислоты происходит увеличение содержания белков с молекулярной массой от 10 до 40 кД [Вовчук и др., 1997а; 19976]. Однако природа этих белков мало изучена. При этом известно, что при вирусной, грибковой и бактериальной инфекциях растений происходят возрастание активности пероксидазы и активация системы генерации 02 [Doke, Ohashi, 1988], причем 02 переводится в Н202 суперок-сиддисмутазой [Apostol et al, 1989]. Вещества, увеличивающие суммарную активность пероксидазы, способствуют повышению

95

Глава III

сопротивляемости растений к патогенам. Пероксидаза относится к классу окислительно-восстановительных ферментов (молекулярная масса 40 кД), способна катализировать окисление различных по строению неорганических и органических соединений. Субстратами пероксидазы могут быть функционально активные вещества: НАДН, мочевая кислота, адреналин, аскорбиновая кислота, гидроксамовые кислоты, абсцизовая кислота и др. [Лебедева, Угарова, 1996]. Показано, что абсцизовая кислота может стимулировать образование изоферментов пероксидазы, при подавлении синтеза которой уменьшалось число изоферментов пероксидазы [Neuman et al, 1992].

Однако механизм индивидуального и совместного пероксидазного окисления салицилата натрия в реакциях, катализируемых пероксидазой, не изучен. Поэтому исследование участия салицилата натрия в пероксидазных реакциях позволило установить, что он является медленно окисляемым субстратом пероксидазы [Рогожин, Верхотуров, 1999а]. В реакциях совместного окисления с ферроцианидом калия связывание салицилата натрия в активном центре фермента не влияло на связывание ферроцианида калия, что проявлялось в реакции пероксидазного окисления ферроцианида в неконкурентном характере ингибирования пероксидазы (рис. 38). Однако если салицилат натрия связывался с ферментом, то дальнейшее превращение ферроцианида калия замедлялось. В реакции пероксидазного окисления о-дианизидина проявлялся смешанный тип ингибирования пероксидазы салицилатом натрия, что свидетельствует о конкуренции между о-дианизидином и салицилатом натрия за место связывания в активном центре фермента (рис. 39). При связывании салицилата натрия с ферментом понижалось сродство и эффективность превращения о-дианизидина. Выявленные механизмы ингибирования пероксидазы салицилатом натрия позволяют предположить, что участки связывания ферроцианида и о-дианизидина в активном центре фермента располагаются вблизи места связывания салицилата натрия. При этом особенности связывания субстратов проявлялись в индивидуальном характере ингибирования их пероксидазного окисления. Однако в процессе окисления ферроцианида и о-дианизидина, по-видимому, реализуются различные каналы электронного транспорта с субстратов, контактирующих с поверхностью белковой глобулы, на железо

96

Пероксидаза в реакциях окисления медленно и быстро окисляемых субстратов

I/v, мин мМ 1 у 4

зо-

20 - ? 2 /у 1

10 -

; * 1 2 3 4

l/[K4Fe(CN)6], мМ"'

Рис. 38. Зависимость начальной скорости пероксидазного окисления ферроцианида калия в обратных координатах в присутствии салицилата натрия, мМ: 1-0; 2-10; 3-20; 4-40; пероксидаза — 20 нМ; перекись водорода — 0,64 мМ; 0,1 М натрий-фосфатный буфер, рН 6,0.

1/о-дианизидин, мМ

Рис. 39. Зависимость начальной скорости пероксидазного окисления о-дианизидина в обратных координатах в присутствии салицилата натрия, мМ: 1-0; 2-10; 3-20; 4-40; пероксидаза — 0,4 нМ; перекись водорода — 0,64 мМ; 0,1 М натрий-ацетатный буфер, рН 4,5.

гема, что и оказывает влияние на эффективность их превращения в реакциях индивидуального и совместного окисления с салицилатом натрия.

Функционально активными веществами, выполняющими ре-гуляторную функцию в