Биологический каталог




Пероксидаза как компонент антиоксидантной системы живых организмов

Автор В.В.Рогожин

азы на смешанный.

100

Пероксидаза в реакциях окисления медленно и быстро окисляемых субстратов

1/о-дианизидин, мМ 1/о-дианизидин, мМ

Рис. 41. Зависимость начальной скорости окисления о-дианизидина при рН 6,0 (а) и 4,5 (б) от его концентрации при различных концентрациях норадреналина, мкМ: 1-0, 2-3,9, 3-7,8, 4-15,6. Концентрации: пероксидазы — 0,18 нМ; перекиси водорода — 0,64 мМ; о-дианизидина — 43—344 мкМ.

На основании полученных данных ингибирования пероксидазного окисления о-дианизидина норадреналином предложена следующая схема 10.

схема 10

Е+НД—Ь->Ц

Е, +ДН2гЬз->Е, -ДН2—^Е2 -Р'—^Е+Р2 К\,4/Г[НА] [HAJlt^Kj, Е, -НА+ДН2<=^^НА-Е, -ДН2—^НА-Е2 -Р'-^Е-НА+Рг

Е — НА, Е, — НА — комплексы нативного фермента и Е, с норадреналином; НА — Е, — ДН2, НА — Е2 — F — тройные комплексы норадреналина, о-дианизидина и полуокисленного о-дианизидина с Е, и Е2 соответственно.

Норадреналин не окисляется соединениями Е, и Е2 пероксидазы, т.е. он не может быть пероксидазным субстратом фермента. Тогда как викасол восстанавливает промежуточные окисленные формы пероксидазы, являясь медленно окисляемым субстратом пероксидазы. При рН 4,5—6,0 викасол не ингиби-ровал фермент в реакциях пероксидазного окисления о-дианизидина и аскорбиновой кислоты, а при рН > 6,5 в реакциях пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты викасол проявлял конкурентный характер ингибирования. В реакциях окисления о-дианизидина тип ингибирования пероксидазы викасолом зависел от рН. При рН 6,5 проявлялся конкурент-

101

Глава III

ный характер ингибирования пероксидазы, а при рН 7,0-8,0 — смешанный тип (рис. 42). Ингибирование пероксидазы викасолом в реакции окисления о-дианизидина менее специфично, чем норадреналином. Связывание викасола с пероксидазой в 400—1000 раз хуже по сравнению с норадреналином. Норадреналин понижает kcat в реакции окисления о-дианизидина в 4—300 раз, а викасол — в 1,2—3,7 раза. Высокая ингибирующая способность пероксидазы, по-видимому, обусловлена наличием 1МН2-группы в молекуле норадреналина.

Ингибирующий эффект викасола, по-видимому, обусловлен тем, что он связывается в месте расположения медленно окисляемых субстратов. За счет этого викасол может конкурировать за центр связывания и влиять на окисление как быстро, так и медленно окисляемых субстратов пероксидазы. На основании полученных данных можно предположить, что пероксидаза имеет два различных участка связывания на поверхности белковой глобулы, расположенных близко друг к другу, используемых для каталитического превращения быстро и медленно окисляемых органических субстратов. При окислении в пероксидазе реализуется несколько каналов электронного транспорта с субстратов, контактирующих с поверхностью белковой глобулы, на железо гема [Угарова и др., 1981]. Доказательством этого является широкая субстратная специфичность пероксидазы.

Поскольку норадреналин проявляет нуклеофильные свойства, то он связывается в том же месте активного центра, что и о-дианизидин. Норадреналин изменяет рКа функциональной группы активного центра пероксидазы в щелочную сторону, увеличивая сродство фермента к субстрату, за счет этого возрастает скорость окисления аскорбиновой кислоты. Норадреналин не окисляется соединениями Е, и Е2 пероксидазы. При окислении о-дианизидина в присутствии норадреналина меж-

102

1/о-дианизидин, мМ

Рис. 42. Зависимость начальной скорости окисления о-дианизидина от его концентрации при различных концентрациях викасола, мМ: 1-0, 2-0,15, 3-0,3, 4-0,6. рН 7,5. Концентрации: пероксидазы — 0,18 нМ; перекиси водорода — 0,64 мМ; о-дианизидина — 43— 344 мкМ.

Пероксидаза в реакциях окисления медленно и быстро окисляемых субстратов

ду ними возникает конкуренция за центр связывания, что является причиной ингибирования пероксидазного окисления о-дианизидина.

3.9. ФУНКЦИОНАЛЬНО ВАЖНЫЕ ГРУППЫ АКТИВНОГО ЦЕНТРА ПЕРОКСИДАЗЫ

Химическая модификация каталитических групп ферментов позволяет установить структуру активного центра и роль отдельных функциональных групп в каталитическом процессе [Шиба-то, 1974]. Ранее было показано, что аминогруппы остатков лизина и поверхностные, т.е. расположенные на поверхности фермента и легко доступные модифицирующим агентам при наиболее компактной конформацни его молекулы, ОН-группы тирозина, серина, треонина и углеводных остатков непосредственно не входят в активный центр пероксидазы [Кутузова, Угарова, 1981]. В то же время известно, что во взаимодействии соединения II пероксидазы (Е2) с органическими субстратами участвуют группы с рК 6,5 и 8,6 [Лебедева и др., 1977]. Можно предположить, что группа с рК 6,5 — это карбоксильная группа остатка аспарагиновой или глутаминовои кислоты, имеющая аномально высокое значение рК.

Молекула изофермента С пероксидазы хрена содержит 31 карбоксильные группы, включая С-концевую и две, принадлежащие пропионовым остаткам гема [Welinder, 1979]. В литературе отсутствуют данные о роли этих групп в функционировании активно^ го центра и поддержании третичной структуры пероксидазы. Поэтому мы изучили роль доступных в обычных условиях (22 "С, рН 5,0) карбоксильных групп пероксидазы хрена в каталитическом процессе окисления органического субстрата о-дианизидина и неорганического — ферроцианида калия ферментом. Для этого использовали модификацию данных групп водорастворимыми карбодиимидами в присутствии и в отсутствие нуклеофильных агентов.

3.9.1. РОЛЬ ДОСТУПНЫХ КАРБОКСИЛЬНЫХ ГРУПП ПЕРОКСИДАЗЫ В ПЕРОКСИДАЗНОМ КАТАЛИЗЕ

Как известно, карбодиимиды активируют карбоксильные группы так, что они приобретают способность реагировать с нук-леофилами [Hoare, Koshland, 1967]. Карбодиимиды, однако, мо-

103

Глава III

тут сами выступать в качестве модифицирующих агентов, давая лабильные производные О-ацилмочевины, перегруппировка которых приводит к образованию устойчивых производных О-ацилмочевины [Hoare, Koshland, 1967; Timkovich, 1977]. Кроме карбоксильных групп карбодиимиды могут модифицировать в белках сульфгидрильные [Carraway, Triplett, 1970], фенольные [Carraway, Koshland, 1968] и аминогруппы (при рН > 9,5) [Riehm, Sheraga, 1966]. Пероксидаза не содержит сульфгидрильных групп, а из пяти ОН-групп тирозина в обычных условиях модифицируется только одна, причем активность фермента при этом не изменяется [Кутузова, Угарова, 1981].

Реакцию с карбодиимидами проводили в условиях, в которых происходит модификация главным образом карбоксильных групп фермента (рН 5,0; 22 °С) [Hoare, Koshland, 1967]. В работе [Кутузова и др., 1983; Рогожин и др., 1983] использовали водорастворимые карбодиимиды: n-толуолсульфонат 1-циклогексил-3-(2-морфо-линоэтил) карбодиимида (СМЕ-карбодиимид), 1-этил-3-(3-диме-тиламинопропил) карбодиимид (EDP-карбодиимид) и иодметилат К-п-фенилазофенил-К'(^К-диметиламинопропил) карбодиимида (PDP-карбодиимид). Последний имеет хромофорную группу, позволяющую определять число остатков, присоединенных к ферменту [Баландина и др., 1975]. В качестве нуклеофильных агентов применяли окрашенные амины: моно-динитрофенилгексаметилен-диамин (DPC-диамин), моно-дини

страница 28
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70

Скачать книгу "Пероксидаза как компонент антиоксидантной системы живых организмов" (3.56Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(16.09.2019)