ких значений рН. В работе [Сова, Еляева, 1978], в частности, описано связывание белком DPG-диамина при инкубации в растворе детергента (бридж-35).

При использовании в качестве нуклеофильных агентов Рг- и GM-диаминов (0,1 М EDP-карбодиимида, 340 моль диамина на 1 моль белка) степень связывания этих диаминов оценивали, определяя количество аминогрупп в белке титрованием тринитро-бензолсульфонатом [Угарова и др., 1978а; 19786]. В случае Рг-ди-амина пероксидазная активность уменьшилась на 70%, причем фермент содержал 3 моль диамина на 1 моль белка. Несколько меньшие потеря активности и связывание диамина наблюдались при применении GM-диамина (табл. 11). Модифицированный фермент по своим спектральным характеристикам не отличался от нативного.

Присутствие в среде диаминов не сказывается на количестве димеров фермента, образующихся при действии на пероксидазу EDP-карбодиимида (15—20%). В то же время связывание диаминов заметно уменьшает подвижность модифицированного белка при его хроматографии на СМ-целлюлозе (рис. 45). Естественно предположить, что в данных опытах диамины подвергались только моноацилированию, т.е. не образовывали меж- или внутри-белковых сшивок.

При действии на пероксидазу EDP-карбодиимида в присутствии гидроксиламина, по-видимому, происходит перегруппировка Лоссеня [Ноаге, Koshland, 1966], поскольку в модифицированном ферменте обнаруживается больше аминогрупп, чем в нативном. По данным титрования тринитробензолсульфонатом, в аминогруппы превращаются семь СООН-групп на молекулу белка. В спектре модифицированного фермента уширяются полосы поглощения гема, так что он становится похож на спектр денатурированной пероксидазы. Вероятно, сильное увеличение положительного заряда молекулы пероксидазы приближает ее конформацию к структуре денатурированного белка. Активность такого препарата составляет 30% от исходной, т.е. примерно такая же, как у пероксидазы, модифицированной EDP-карбодии-мидом в отсутствие гидроксиламина (табл. 11).

Каталитические свойства пероксидазы,.модифицированной карбодиимидами, были изучены в реакциях окисления о-дианизидина, ферроцианида калия и их смеси. При окислении о-диа-

109

Глава III

низидина перекисью водорода рН-зависимости кса( и Кт (3,5 < < рН < 9) одинаковы у исходных и модифицированных препаратов. Следовательно, модифицируемые карбоксильные группы не ответственны за уменьшение активности, наблюдаемое при увеличении рН. Данные (рис. 46) показывают, что модификация карбоксильных групп карбодиимидами приводит к резкому уменьшению к „ при незначительном изменении К .

cat' ^ m

Влияние модификации карбоксильных групп фермента на кинетику окисления перекисью водорода неорганического субстрата — ферроцианида калия — мы изучили на примере пероксидазы, обработанной EDP-карбодиимидом. Значения kcat и Кт после модификации практически не изменяются в диапазоне рН 4,0-8,0 и совпадают с данными для нативной пероксидазы, которые приведены в работе [Лебедева и др., 1981J. Таким образом, модификация карбодиимидами карбоксильных групп пероксидазы не сказывается на окислении ферроцианида.

Изучение кинетики окисления смеси двух субстратов, о-дианизидина и ферроцианида калия при рН 4,0—8,0 дало возможность

определить константы индивидуальных стадий окисления о-дианизидина (рис. 47) (метод предложен в [Лебедева и др., 1981]). После обработки пероксидазы EDP-карбодиимидом в оптимуме каталитической активности при рН 5 в 8 раз уменьшается Ц, т.е. константа скорости переноса первого электрона с о-дианизидина на Е, и примерно в 2 раза — к4, т.е. константа скорости окисления о-дианизидина промежуточной формой пероксидазы Е2 (табл. 12). В то же время в 2 раза уменьшается К = к 2/ Ц, т.е. улучшается связывание о-дианизидина с Е . Ранее было найдено, что при пероксидазном окислении о-дианизидина к3 = 10 • к4 и поэтому кса( = к4. Иными словами, лимитируюшей стади-

110

1-

lgkca„lgKm + 6

3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,5

рН

Рис. 46. рН-зависимости каталитиче-скихконстантк ,(1-5)иК (Г-5')окис-

cat х ' m х '

ления о-дианизидина в присутствии пероксидазы нативной (1, Г), модифицированной PDP — (2, 2') EDP (3, 3'), СМЕ-карбидиимидами (5, 5'), а также EDP-карбодиимидами в присутствии DPG-диамина (4,4'). 0,01 М буфер (рН 3,7-5,5 — Na-аиетатный, рН 6-8 — Na-фосфатный) 0,1 М KN03,0,65 мМ Н202 0,2-0,4 нМ пероксидаза, 5-170 мкМ о-дианизидин.

Пероксидаза в реакциях окисления медленно и быстро окисляемых субстратов

ей здесь является окисление о-дианизидина промежуточной формой пероксидазы Е2 [Лебедева и др., 1977; Лебедева и др., 1981]. В случае пероксидазы, обработанной EDP-карбодиимидом, значения к3 и к4 оказываются сравнимыми по величине (табл. 12) и, следовательно, для модифицированного фермента в отличие от нативного экспериментально определяемая величина kcm является функцией констант к3 и к4. Таким образом, константы скорости окисления о-дианизидина формами Е, и Е2 после модификации карбоксильных групп не только уменьшаются, но и становятся сравнимыми по величине.

В отдельных опытах было показано, что присутствие в среде аминов, диаминов и гидроксила-мина при обработке пероксидазы EDP-карбодиимидом не сказывается на значениях kcat и Кт, свойственных ферменту, модифицированному одним EDP-карбодиимидом. Таким образом, эти кинетические характеристики изменяются непосредственно в результате взаимодействия пероксидазы с карбодии-мидом.

Полученные данные показывают, что лишь несколько из 31 имеющихся в пероксидазе карбоксильных групп доступны модифицирующим агентам. Остальные находятся, вероятно, внутри глобулы.

Таблица 12

Кинетические параметры реакции пероксидазного окисления о-дианизидина. Рассчитаны из данных об окислении смеси о-дианизидина и ферроцианида калия; условия см. подпись к рис. 47; рН 5,0

Препарат к210 \ с' к, 10 \ с ' К,10',М

Нативная пероксидаза 20 2,9 5,5

Пероксидаза, модифицированная EDP- 2,5 1,7 2,6

карбодиимидом

111

5-1 lgkj.igKs + e

3,5 4,5 5,5 6,5 7,5

рН

Рис. 47. рН-зависимости величин lg Ц (1, 2) и lg К (Г, 2') для индивидуального окисления о-дианизидина, найденных из данных о совместном окислении перекисью водорода ферроцианида калия и о-дианизидина для нативной (1,1') и модифицированной PDP-карбодиимидом (2, 2')- Условия те же, что на рис. 46; концентрация ферроцианида калия — 0,1 мМ.

Глава III

Изучение каталитических свойств пероксидазы, обработанной карбодиимидами, показало, что модифицируемые ими частично маскированные карбоксильные группы располагаются вблизи участка активного центра фермента, ответственного за связывание органического субстрата (о-дианизидина). Объемистые ацилмочевинные остатки экранируют активный центр; следствием этого является уменьшение констант скоростей переноса электрона с донора водорода — о-дианизидина — на окисленные формы пероксидазы Е, и Е2. В то же время усиливается связывание о-дианизидина с ферментом. Неорганические субстраты связываются в другом участке активного центра перок