сидазы, что и проявляется в особенностях механизма их окисления. Возможно поэтому модификация карбоксильных групп, функционально важных для окисления о-дианизидина, не влияет на окисление ферроцианида калия. Дополнительная модификация трех — семи экспонированных в раствор карбоксильных групп пероксидазы нуклеофильными агентами не влияет на каталитические свойства фермента.

3.9.2. СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧИСЛА ДОСТУПНЫХ КАРБОКСИЛЬНЫХ ГРУПП В БЕЛКАХ С ПОМОЩЬЮ О-ДИАНИЗИДИНА И ВОДОРАСТВОРИМОГО КАРБОДИИМИДА

Метод количественного определения степени модификации карбоксильных групп в белках, предложенный Кошландом [Ноаге, Koshland, 1967; Carraway, Koshland, 1972], основан на активации СООН-групп водорастворимым карбодиимидом с последующим замещением карбодиимида нуклеофилом — метиловым эфиром глицина. Число модифицированных групп определяется либо с помощью аминокислотного анализа, что весьма трудоемко и не позволяет детектировать малые степени модификации, либо методом меченых атомов, что требует использования реагентов, содержащих радиоактивные изотопы. Ранее был предложен ряд методов спектрофотометрического определения модифицированных карбоксильных групп с помощью карбодиимидов или нук-леофилов, содержащих хромофорные заместители [Баландина и др., 1975; Матяш и др., 1972]. Однако эти реагенты имеют ряд существенных недостатков. Окрашенный нуклеофил — динитрофе-нилгексаметилендиамин (DPG-диамин) мало реакционноспосо-бен и, кроме того, сильно сорбируется на белке [Угарова идр., 1982].

112

Пероксидаза в реакциях окисления медленно и быстро окисляемых субстратов

Его полоса поглощения (360 им) перекрывается с полосой Соре в гемовых белках, что затрудняет количественное определение числа присоединившихся остатков DPG-диамина и спектрофотометри-ческое определение концентрации модифицированного гембелка. Водорастворимый карбодиимид, содержащий хромофорную группу (иодметилат^-п-фенилазофенил^ХМ,№-диметиламино-пропил) карбодиимид) нередко образует с белками неустойчивые соединения, которые разрушаются при хроматографической очистке модифицированного белка [Угарова и др., 1982].

Для определения числа доступных в данных условиях карбоксильных групп в белках в известной реакции их с водорастворимым карбодиимидом мы предлагаем использовать в качестве нук-леофильного агента о-дианизидин (3,3-диметоксибензидин). Этот реагент содержит две аминогруппы с рК 3,6 и 4,7 [Moller, Ottolenghi, 1966], имеет максимум поглощения при 300 нм (е = = 16,5 мМ-|см~' в 0,05 М NaCl), не поглощает в видимой области (рис. 48) и, как будет показано ниже, высокореакционноспосо-бен. Его особенно целесообразно использовать для исследования гемсодержащих белков и ферментов у которых в спектрах при 300—320 нм наблюдается минимум поглощения, что дает возможность с большей точностью определять степень модификации СООН-групп белка, чем при использовании нуклеофилов, поглощающих в области полосы Соре. Например, для пероксидазы хрена минимум поглощения в УФ области спектра наблюдается при 315 нм (е= 15 мМ"'см_|, см. рис.48, а). При использовании же в качестве нуклеофила DPG-диамина измерение поглощения проводят при 360 нм (е= 15 мМ~'см~'), где пероксидаза имеет е= 45 мМ"'см_|.

Нами разработан метод спектрофотометрического определения числа доступных карбоксильных групп в белках с использованием о-дианизидина и 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)кар-бодиимида (EDP-карбодиимид) и с помощью этого метода выявлено число доступных и функционально важных карбоксильных групп в пероксидазе хрена.

Перспективность использования о-дианизидина в качестве высокореакционного нуклеофила для определения доступных СООН-групп в белках наглядно видно на примере модификации пероксидазы хрена. Пероксидазу модифицировали по методу Кошланда [Hoare, Koshland, 1967], используя 0,01 и 0,1 М EDP-карбодиимид и 0,43 мМ о-дианизидин.

113

Глава III

е, мМ см

100-

Рис. 48. а — спектры поглощения нативной (1) и модифицированной (4 СООН-группы) о-диани-зидином (2) пероксидаз, их разностный спектр (3); б— спектры о-дианизидина в растворе (1) и о-дианизидина, связанного с белком (2). Условия: 22 °С, 0,05 М NaCl.

е, мМ см

- 10

-5

Я., нм

Растворимость о-дианизидина в воде мала [Moller, Ottolenghi, 1966], поэтому исходный раствор его (4,3 мМ) готовили в абсолютном этиловом спирте в результате чего реакционная смесь при модификации содержала примерно 10% спирта.

Для модифицированной EDP-карбодиимидом и о-дианизиди-ном пероксидазы увеличивается поглощение в УФ-области и не наблюдается изменений в поглощении ни в области полосы Соре, ни в видимой области. Спектр пероксидазы, модифицированной только EDP — карбодиимидом, тождественен спектру нативной пероксидазы. Разностный спектр модифицированного и нативного

114

Пероксидаза в реакциях окисления медленно и быстро окисляемых субстратов

фермента свидетельствует о том, что остатки о-дианизидина, ковалентно связанные с белком, имеют максимум поглощения при 305 нм, а не при 300 нм, как исходный о-дианизидин в растворе (рис. 48, б). Модельное соединение — N-ацетил-о-дианизидин — имеет спектр поглощения той же формы, что и о-дианизидин, ковалентно связанный с белком. Молярный коэффициент поглощения модельного соединения, который принимали за молярный коэффициент поглощения остатков о-дианизидина, ковалентно связанных с белком, при 305 нм составляет 19,0 мМ-1 см-1 (рис. 48, б).

Модифицированный фермент не содержит примеси натив-ного белка, как показано хроматографией на СМ-целлюлозе при рН 5,0 и 4,0 в градиенте Na-ацетатного буфера (0,005—1,5 М). Из-за увеличения общего положительного заряда молекулы модифицированная пероксидаза элюируется при большей ионной силе, чем нативная и тем позже, чем выше степень модификации карбоксильных групп (рис. 49). Ранее мы показали, что при модификации пероксидазы DPG-диамином и карбодиими-дом основная часть DPG-диамина связывается с пероксидазой нековалентно и отделяется от белка при хроматографии на СМ-целлюлозе [Угарова и др., 1982]. В данном случае число остатков о-дианизидина, связанных с белком, после хроматографии не изменяется, что свидетельствует об отсутствии неспецифической сорбции о-дианизидина на белке. Методом гель-хроматографии на сефадексе G-100 мы показали, что модифицированная о-дианизидином и EDP-карбодиимидом пероксидаза не содержит межмолекулярных сшивок, в то время как при использовании в качестве нук-леофилов других диаминов образовывалось до 20% димеров фермента.

20 40 60

Рис. 49. Хроматография на СМ-целлюлозе нативной и модифицированной 0,01 М EDP-карбодиимидом пероксидаз (1), пероксидазы, модифицированной в течение 1,5 ч 0,1 М EDP-карбодиимидом (2), и пероксидазы, модифицированной EDP-карбодиимидом в присутствии о-дианизидина (3, 4); 3 — модифицировано 4 СООН-группы, 4 — модифицировано 7 СООН-групп. Прямой линией показан градиент буферного раствора.

115

Глава III

Следует отметить ряд других преимуществ о-дианизидина как нуклеофила в реакциях модификации СООН-групп белков при участии карбодиимида.