1. о-Дианизидин обладает гораздо большей реакционной способностью, чем другие, обычно используемые нуклеофилы — амины и диамины, поскольку, как было показано нами, при концентрациях, в десятки раз меньших (и прочих равных условиях), модифицирует в пероксидазе большее число карбоксильных групп. Таким образом, используя малые (0,4—0,6 мМ) концентрации о-дианизидина, можно осуществить модификацию всех доступных СООН-групп в компактной нативной конформацни белковой глобулы, в то время как при обычно используемых концентрациях нуклеофилов (до 1 М) нативная структура белка может быть нарушена.

2. Максимум поглощения о-дианизидина, ковалентно связанного с белками, лежит в области минимального поглощения гем-содержащих белков, что уменьшает ошибку при расчете малых степеней модификации СООН-групп. Кроме того, для гемопро-теинов молярный коэффициент поглощения в области полосы Соре после присоединения о-дианизидина не изменяется. Это позволяет определять концентрацию модифицированного белка, как и нативного, спектрофотометрически по поглощению в области полосы Соре.

На примере трипсина мы показали, что о-дианизидин удобно использовать также для модификации СООН-групп в других, не содержащих гем белках, поскольку их поглощение при 305 нм не превышает 15%-ного поглощения при 280 нм.

3. С помощью двойной модификации: сначала используя нук-леофил, не несущий хромофорной группы, а затем проводя модификацию повторно в присутствии о-дианизидина, можно определять число модифицированных первым нуклеофилом СООН-групп белка, в частности, можно определить число СООН-групп, модифицирующихся одним карбодиимидом.

Применение о-дианизидина может быть ограничено лишь тем, что из-за его малой растворимости в воде реакционная среда должна содержать около 10% спирта. Однако, несмотря на это, все сказанное выше показывает преимущества и перспективность использования о-дианизидина как нуклеофила по сравнению с другими обычно используемыми нуклеофилами для быстрого определения количества доступных СООН-групп в

116

Пероксидаза в реакциях окисления медленно и быстро окисляемых субстратов

белках и для изучения их расположения в молекуле при различных условиях.

Известно, что при активации карбоксильных групп карбодиимидами образуются неустойчивые промежуточные производные О-ацилизомочевины [Hoare, Koshland, 1967]. В отсутствие нуклеофила эти производные либо гидролизуются водой (если СООН-группы полностью экспонированы в растворитель), либо перегруппировываются в устойчивые производные N-ацилмоче-вины (III) если они маскированы для растворителя и нуклеофила [Timkovich, 1977].

В присутствии нуклеофила активированные СООН-группы, экспонированные в растворитель, либо гидролизуются, либо ковалентно присоединяют молекулу нуклеофила, а активированные СООН-группы, которые маскированы для растворителя и нуклеофила, претерпевают перегруппировку в N-ацилмочевину, причем последний процесс протекает во много раз медленнее, чем реакции с нуклеофилом [Hoare, Koshland, 1967]. Таким образом, в зависимости от расположения в глобуле и условий модификации карбоксильные группы белка либо совсем не модифицируются, если находятся вдали от поверхности молекулы и стерически недоступны, либо могут модифицироваться только карбодиимидом, либо только нуклеофилом, либо и тем и другим. Мы смогли дифференцировать модифицируемые СООН-группы пероксидазы по их расположению в глобуле фермента, проводя модификацию EDP-карбодиимидом в отсутствие и в присутствии о-дианизидина.

При реакции пероксидазы с EDP-карбодиимидом в отсутствие о-дианизидина о степени модификации СООН-групп EDP-карбодиимидом можно судить по изменению подвижности модифицированного фермента при хроматографии на СМ-целлюлозе. Пероксидаза, обработанная 0,01 М EDP-карбодиимидом при рН 5,0 в течение 1,5 ч, хроматографируется подобно нативному ферменту (рис. 49, кривая 1). Однако объем элюции пероксидазы, модифицированной 0,1 М EDP-карбодиимидом в тех же условиях, больше, чем нативной (рис. 49, кривая 2).

Следовательно, при 0,01 М концентрации EDP-карбодиими-да и рН 5,0 за 1,5 ч не происходит модификации СООН-групп пероксидазы с образованием устойчивых производных N-ацил-мочевины. 0,1 М EDP-карбодиимид в тех же условиях модифицирует некоторое количество СООН-групп пероксидазы.

117

Глава III

Таблица 13

Зависимость числа присоединившихся к пероксидазе остатков о-дианизидина и активности модифицированной пероксидазы от концентрации модифицирующих агентов. Условия реакции модификации: 22 "С, 1,5 ч, рН 5,0, концентрация пероксидазы 0,025 мМ

Концентрация модифицирующих агентов Число присоединенных остатков о-дианизидина Активность, % от нативного фермента

EDP-карбодиимида, М о-дианизидина, мМ 0,01 — — 100

0,1 — — 45

0,01 0,65 3 30

0,1 0,43 4 20

0,1 — 45

0,1 —

0,1 — 2 20

0,1 0,43 - -

Изучена зависимость числа присоединяемых молекул о-дианизидина от концентрации EDP-карбодиимида (табл. 13), времени модификации и рН среды при постоянной концентрации пероксидазы и о-дианизидина (соотношение о-дианизидин/пе-роксидаза = 17,2). При рН 5,0 и 0,01 М EDP-карбодиимиде (соотношение EDP-карбодиимид/ пероксидаза = 400) модификация протекает медленно и не заканчивается даже за 4 ч. При этом к ферменту присоединяется до трех остатков о-дианизидина (рис. 50, кривая 1). В присутствии 0,1 М EDP-карбодиимида (соотношение EDP-карбодиимид/перок-сидаза = 4000) уже за 1,5 ч достигается максимальная степень модификации о-дианизидином (четыре СООН-группы), и далее число модифицированных СООН-групп не увеличивается (рис. 50, кривая 2).

При использовании 0,1 М EDP-карбодиимида в 1,5 раза большей концентрации о-дианизидина и прочих равных условиях в фермен-

1п

Время, мин

Рис. 50. Зависимость числа присоединенных к пероксидазе молекул о-дианизидина (п) от длительности модификации. Условия модификации: 22 "С, рН 5,0. Концентрации: пероксидаза — 25 мкМ; о-дианизидин — 0,43 мМ; EDP-карбодиимид — 0,01 (1), 0,1(2).

118

Пероксидаза в реакциях окисления медленно и быстро окисляемых субстратов

те также модифицируются только четыре СООН-группы. Следовательно, при рН 5,0 и 22 °С конформация молекулы пероксидазы такова, что экспонированными и доступными модифицирующим агентам являются лишь четыре (из 31) СООН-группы фермента. Остальные СООН-группы, вероятно, маскированы и недоступны в этих условиях модифицирующему агенту.

При рН 4,0 и 0,1 М EDP-карбодиимиде 0,43 мМ о-дианизидин в пероксидазе максимально модифицирует семь СООН-групп. Различие в степени модификации фермента при рН 5,0 и 4,0 объясняется, по-видимому, тем, что при уменьшении рН происходит некоторое «разрыхление» белковой глобулы пероксидазы, в результате чего доступность СООН-групп возрастает.

Таким образом, благодаря высокой реакционной способности о-дианизидина мы смогли изучить кинетику реакции модификации и определить максимальное число доступных СООН-групп в пероксидазе при рН 5,0 и 4,0.

Количество СООН-групп пероксидазы, ко