Биологический каталог




Пероксидаза как компонент антиоксидантной системы живых организмов

Автор В.В.Рогожин

торые модифицируются EDP-карбодиимидом в отсутствие нуклеофила, мы определили методом повторной модификации. Сначала фермент инкубировали 1,5 ч с 0,1 М EDP-карбодиимидом при рН 5,0 в отсутствие о-дианизидина, отделяли избыток реагента, затем проводили повторную модификацию, используя 0,1 М EDP-карбодиимид и 0,43 мМ о-дианизидин. При этом о-дианизидин модифицировал не четыре, а лишь две СООН-группы (табл. 13). Следовательно, в отсутствие о-дианизидина EDP-карбодиимид модифицирует две частично маскированные для растворителя СООН-группы с образованием N-ацилмочевины. Две карбоксильные группы, которые модифицируются только о-дианизи-дином, по-видимому, более экспонированы в растворитель, чем две другие СООН-группы, которые модифицируются как карбо-диимидом, так и нуклеофилом в присутствии карбодиимида.

Следовательно, четыре максимально доступные модификации о-дианизидином при рН 5,0 карбоксильные группы пероксидазы мы смогли отнести к двум типам: две СООН-группы полностью экспонированы в растворитель и две частично маскированы.

Используя 0,01 М EDP-карбодиимид и варьируя длительность реакции модификации и концентрации о-дианизидина, мы получили препараты модифицированного фермента, содержащие различное число присоединенных остатков о-дианизидина. Фракции с одинаковой степенью модификации выделя-

119

Глава 111

80-

60-

40

20

1

Рис. 51. Зависимость относительной активности пероксидазы от числа присоединенных остатков о-дианизидина (п).

юо-к А.% ли хроматографически на СМ-

целлюлозе. Мы показали, что препараты с одинаковым числом модифицированных СООН-групп имели одну и ту же активность независимо от того, достигали мы необходимую степень модификации варьированием концентрации о-дианизидина или длительности реакции. Причем, как было показано выше, в этом случае не происходит модификация СООН-групп пероксидазы EDP-карбодиимидом с образованием N-ацилмочевины. Зависимость активности пероксидазы от степени модификации СООН-групп о-дианизи-дином в присутствии 0,01 М EDP-карбодиимида показана на рис. 51. При увеличении числа модифицированных групп до трех активность фермента падает до 30% и далее не уменьшается, хотя число модифицированных СООН-групп может быть увеличено до четырех. Эти три СООН-группы функционально не совсем равноценны: модификация первой снижает активность пероксидазы на 30%, а каждой следующей — на 20%. Возможно, СООН-группа, модифицирующаяся о-дианизидином первой, и есть та единственная группа, модификация которой карбодиимидом, содержащим хромофорную группу, уменьшает на 35% активность пероксидазы.

Используя 0,1 М EDP-карбодиимид и о-дианизидин, мы также получили фермент с тремя модифицированными о-дианизидином группами, однако активность его составляла лишь 20% от нативной. Время удерживания модифицированного таким образом фермента на колонке с СМ-целлюлозой также значительно увеличивалось. Следовательно, в этом случае происходит модификация дополнительных СООН-групп пероксидазы EDP-карбодиимидом с образованием N-ацилмочевины, что несколько уменьшает каталитическую активность фермента.

Обработка пероксидазы 0,1 М EDP-карбодиимидом снижает ее активность до 45% от нативной. Повторная обработка карбодиимидом не изменяет активности фермента (табл. 13). Как было показа-

ло

Пероксидаза в реакциях окисления медленно и быстро окисляемых субстратов

но выше, при этом карбодиимидом модифицируются две из трех функционально важных СООН-групп пероксидазы. Последующая модификация данного препарата о-дианизидином уменьшает активность фермента до 20% за счет модификации еще одной функционально важной СООН-группы, так же как и в случае, когда первоначально для модификации используют 0,1 М EDP-карбодиимид и о-дианизидин. Таким образом, из четырех доступных при рН 5,0 СООН-групп пероксидазы функционально важными для процесса окисления о-дианизидина являются три фуппы.

рН-Зависимости каталитических констант окисления о-дианизидина из реакции совместного пероксидазного окисления о-дианизидина и ферроцианида калия были получены для пероксидазы с тремя модифицированными о-дианизидином СООН-группами (рис. 52). Константы индивидуальных стадий пероксидазного окисления о-дианизидина (к3 и к4), характеризующие скорости переноса электронов с субстрата на промежуточные формы Е, и Е2 пероксидазы, а также константа связывания субстрата о-дианизидина формой Е, пероксидазы (К.) были определены как описано ранее [Лебедева, 1981 ]. Модификация трех функционально важных СООН-групп пероксидазы уменьшает значения к3 и к4 (к3 примерно в 10 раз, а к4 в 1,5 раза) во всем диапазоне рН, при этом связывание субстрата несколько улучшается (К уменьшается в 1,5 раза) и в меньшей степени зависит от рН, чем для нативной пероксидазы. В то же время каталитические параметры реакции пероксидазного окисления ферроцианида калия для пероксидазы с тремя модифицированными СООН-группами не отличаются от параметров для на-тивного фермента так же, как и в работе [Угарова и др., 1982].

lgk3,lgKs+6

3,5

4,5

5,5 6,5 7,5

рн

Рис. 52. Зависимости каталитических констант к3 (1, 2) и К (Г, 2') окисления о-дианизидина перекисью водорода для нативной (1, Г) и модифицированной (2, 2') о-дианизидином (3 СООН-групп) пероксидазы, полученные при совместном окислении о-дианизидина и ферроцианида калия. Условия: 22 °С, 0,01 М буфер (рН 4,0-5,5 - Na-ацетатный, рН 6,0—8,0 — Na-фос-фатный), 0,1 М KNO}. Концентрации: пероксидаза — 0,1-0,4 нМ; K4[Fe(CN)6] — 0,1 мМ; о-дианизидин — 7,8-172 мкМ; НгОг - 0,7 мМ.

121

Глава III

Таким образом, из четырех доступных модификации СООН-групп фермента три группы, хотя и в не совсем равной степени, функционально важны для пероксидазного окисления о-дианизидина — донора водорода, но не участвуют в окислении донора электрона — ферроцианида калия. Одна из трех групп полностью экспонирована в раствор и модифицируется только нуклеофилом — о-дианизидином. Две другие несколько маскированы для растворителя и могут быть модифицированы как нуклеофилом, так и карбодиимидом с образованием устойчивых производных N-ацилмочевины (в отсутствие нуклеофила).

После модификации трех функционально важных СООН-групп пероксидазы остаточная активность составляет 30% активности нативного фермента. По-видимому, эти группы расположены вблизи участка связывания о-дианизидина и важны для процесса переноса электронов с органического субстрата — донора водорода — на промежуточные формы Е, и Е2 пероксидазы. В результате модификации о-дианизидином изменяется заряд, увеличивается объем и гидрофобность СООН-групп, поэтому уменьшение констант Ц и к4 может быть обусловлено также затруднением диссоциации и выхода продукта в раствор. В то же время связывание органического субстрата, о-дианизидина с ферментом по этим же причинам может облегчаться. На пероксидазное окисление субстратов, связывающихся в других участках активного центра пероксидазы, модификация СООН-групп фермента не оказывает влияние.

Таким образом, на основании проведенных исследований химической модификации пероксидазы

страница 33
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70

Скачать книгу "Пероксидаза как компонент антиоксидантной системы живых организмов" (3.56Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(17.09.2019)