можно высказать предположение, что в активном центре пероксидазы имеется несколько участков связывания субстратов. Поэтому поверхностными и доступными модификации являются лишь те боковые функциональные группы белка, которые входят в участок активного центра фермента, предназначенного для связывания о-дианизидина. Основная часть функциональных групп пероксидазы, в том числе и группы, входящие в состав других участков активного центра, маскированы либо располагаются внутри белковой глобулы, либо защищены углеводными остатками и поэтому недоступны модифицирующим агентам. Такая структурная организация пероксидазы обусловлена особенностями механизма действия этого фермента, т.е. необходимостью защищать каталитически важные функцио-

122

Пероксидаза в реакциях окисления медленно и быстро окисляемых субстратов

нальные группы от действия свободных радикалов — промежуточных продуктов пероксидазного окисления субстратов, которые могут инактивировать фермент.

3.9.3. РОЛЬ КАРБОКСИЛЬНЫХ ГРУПП ГЕМИНА В МЕХАНИЗМЕ ДЕЙСТВИЯ ПЕРОКСИДАЗЫ

Пероксидаза относится к группе сложных белков, состоящих из апобелка и гемина. Гемин нековалентно связан с белком за счет гидрофобных и ионных связей. Один из пропионовокислых остатков гемина образует ионную связь с одной из аминогрупп белка. Причем нарушение этой связи приводит к понижению активности пероксидазы [Савицкий, 1979].

Ранее было высказано предположение о наличии остатка Asp-43 в дистальной области активного центра пероксидазы [Araiso, Dunford, 1979] и показано, что пропионовокислые остатки гемина важны для его правильной ориентации на белке [DiNello, Dolphin, 1981], но непосредственно не участвуют в образовании соединения Е, пероксидазы с Н202 [Araiso, Dunford, 1981]. Однако оставался неясным вопрос об эквивалентности по своим структурно-организационным и функциональным свойствам СООН-группы гемина в положении 6 и 7 и участвуют ли они в образовании соединения Е2 и в его взаимодействии с субстратами-восстановителями. Поэтому мы изучили роль карбоксильных групп гемина в катализе пероксидазы. Для этого из модифицированной о-дианизидином пероксидазы был выделен гемин (м-гемин) и изучены его некоторые свойства. В ИК-спектрах м-гемина проявлялось уменьшение пика при 1720 см-1 (СООН-группа) и появлялся пик при 1650 см-1 (амидная группа); изменялись также величины Rf. Однако скорость рекомбинации нативного апобелка с м-гемином, выход реконструированного фермента и его активность по о-дианизидину мало отличались от аналогичных характеристик пероксидазы, полученной при рекомбинации нативного белка и нативного гемина (табл. 14). Анализ спектров поглощения реконструированной из нативного апобелка и м-гемина пероксидазы показал, что фермент содержит один остаток о-дианизидина. Следовательно, при модификации о-дианизидином СООН-групп пероксидазы модифицируется также один пропионовокислый остаток гемина. Полученные данные по модификации гемина в пероксидазе явно показывают неэкви-

123

Глава III

Таблица 14

Свойства гемина, выделенного из нативной и модифицированной о-дианизидином пероксидазы, и свойства пероксидазы, реконструированной из нативного апофермента и различных препаратов гемина

Пероксидаза, из которой выделен гемин, используемый для реконструкции Активность* исходных препаратов пероксидазы, % Величины К,** гемина Выход реконструированной пероксидазы, % от апобелка Активность реконструированной пероксидазы*, %

Нативная 100 0,53 93 100***

Модифицированная о-дианизидином (4 СООН-груп-пы) 30 0,85 82 75

* — Условия определения активности те же, что на рис. 52.

** — Величины определены методом тонкослойной хроматографии в системе

гексан-хлороформ-этанол (1:1:1).

*** — Активность пероксидазы, реконструированной из нативного кофермента и нативного гемина, принимали за 100%.

валентность пропионовокислых остатков гемина в положении 6 и 7, что проявлялось при связывании гемина со специфическим апоферментом. Один пропионовокислый остаток гемина в пероксидазе расположен вблизи поверхности молекулы фермента и модифицируется о-дианизидином. Этот остаток не участвует ни в связывании гемина с белком, ни в пероксидазном окислении субстратов. Второй остаток маскирован внутри глобулы и недоступен модификации при рН 5,0. Именно этот остаток образует внутримолекулярную связь с белком, и его модификацией объясняется отмеченное в работе [Araiso, Dunford, 1981] значительное снижение скорости рекомбинации гемина с апопероксидазой, уменьшение выхода и активности реконструированного фермента при использовании для рекомбинации модифицированных геминов.

Таким образом, на основании данных по химической модификации нативной пероксидазы и исследований реконструированной пероксидазы можно предположить, что гемин фермента погружен глубоко во внутрь белковой глобулы. При этом его ви-нильные группы направлены в глубь белка, а остатки пропионо-вых кислот в положениях 6 и 7 ориентированы наружу. Поэтому доступной для модифицирующих соединений является только одна из СООН-групп гема, тогда как вторая погружена во внутрь глобулы и недоступна модифицирующим агентам.

124

Пероксидаза в реакциях окисления медленно и быстро окисляемых субстратов

3.9.4. ИНГИБИРОВАНИЕ ПЕРОКСИДАЗЫ N-ЭТИЛАМИДОМ О-СУЛЬФОБЕНЗОИЛУКСУСНОЙ КИСЛОТЫ

С целью определения локализации модифицированной кар-бодиимидом карбоксильной группы пероксидазы, мы применили метод ингибиторного анализа с использованием сходного по строению с субстратом (о-дианизидином) ингибитора, который не участвует в окислительно-восстановительных реакциях пероксидазы, но может конкурировать за центр связывания с одним из ее субстратов [Рогожин и др., 20006]. Это позволило исследовать субстрат связывающую площадку активного центра фермента, а также оценить степень доступности карбоксильных групп после модификации и каталитические характеристики нативной и модифицированной и-толуолсульфонат 1-циклогексил-3-(2-мор-фолиноэтил) карбодиимидом пероксидазы. В качестве ингибитора использовали N-этиламид о-сульфобензоилуксусной кислоты (амид III).

Известно, что изучение влияние ингибиторов на каталитическую активность ферментов является одним из методов, позволяющих исследовать их механизм действия. Ингибиторный метод был использован и ранее для исследования механизма пероксидазного окисления неорганических и органических соединений, катализируемого пероксидазой [Pettigrew et all., 1976]. Ингибиторы пероксидазы могут различными путями влиять на катализируемый ферментом окислительный процесс. Ионы цианида, фторида и азида подавляют каталитическую активность пероксидазы за счет образования прочных комплексов по шестому координационному положению железа гема, предотвращая реакцию с перекисью водорода. Ряд органических соединений ингибируют пероксидазу, реагируя с ее промежуточными Е, и Е2 соединениями. Некоторые из них, такие как аскорбиновая кислота, НАДН [Лебедева, Угарова, 1997], сахара [Saunders et. al., 1964], тиомочевина [Pettigrew et al., 1976], относятся к медленно окисляемым