курентное ингибирование). Наблюдаемый тип ингибирования нативной пероксидазы амидом, по-видимому, можно объяснить наличием обширной субстрат-связывающей площадки в активном центре фермента, где могут разместиться и ингибитор (амид III) и субстрат (о-дианизидин), а также влиянием амида III на процесс пероксидазного окисления о-дианизидина, причем связывание одного из них затрудняет последующее связывание другого, т.к. величина а увеличивается от 4,3 при рН 5,0 до 17,7 при рН 7,5, при этом значения Кт и К. становятся соизмеримы (табл. 15). В то же время скорость окисления о-дианизидина в комплексе пероксидаза—амид III возрастает (постоянная [3 увеличивается в 2 раза) (табл. 15).

схема 11

Е+НД—^Е, Ej+St-^E, -S-^->E2 -F—^Е+Р К,. IT I I IT aKj

Et -I+S^^I-Ej -S-^->I-E2 -P'-P^E-I+P

E, E, и E2 — нативная пероксидаза и ее окисленные формы; S и I — о-дианизидин и амид III; Е, - S, Е2 - F, Е, -1,1 - Е, - S, I - Е2 - F — комплексы окисленных форм пероксидазы с о-дианизидином в отсутствие и присутствии амида III.

129

2-| lgK^lgKj+l -3 Н X—""ft" и _

-4-

-5

А 3

4,5 5,5 6,5 7,5

рН

Рис. 56. рН-зависимости констант Михаэлиса (1,2) и констант ингибирования амидом III (3, 4) пероксидазного окисления о-дианизидина в присутствии нативной (2, 3) и модифицированной СМЕ-карбодиимидом (1, 4) пероксидазы.

Глава III

Полное конкурентное ингибирование пероксидазы, модифицированной СМЕ-карбодиимидом, объясняется, по-видимому, введением в область активного центра фермента остатка карбодиимида, что создает пространственные затруднения для связывания о-дианизидина с комплексом пероксидаза-ингибитор. Изменения профиля рН-зависимости К. для модифицированной пероксидазы при рН < 6,0 может быть обусловлено изменением заряда в области активного центра пероксидазы вследствие модификации карбодиимидом карбоксильных групп, расположенных вблизи активного центра фермента.

Таким образом, в области активного центра нативной пероксидазы имеется протяженная субстратсвязывающая площадка, представленная несколькими участками индивидуального связывания субстратов, что создает условие для одновременного связывания ингибитора и субстрата. Причем, связывание одного из них затрудняет последующее связывание другого. В то же время в комплексе фермент-ингибитор-субстрат процесс превращения субстрата несколько ускоряется (JJ > 1). В модифицированной пероксидазе, в области субстрат-связывающей площадки (участке связывания о-дианизидина), по-видимому, находится по крайней мере один остаток карбодиимида в результате чего возникают стерические затруднения для одновременной посадки ингибитора и субстрата. Однако их индивидуальное связывание модифицированной пероксидазой несколько улучшается. Полученные данные показывают, что по крайней мере одна из модифицируемых СООН-группа пероксидазы располагается в области активного центра фермента в участке связывания о-дианизидина. Модификация этой группы оказывает влияние на процесс связывания о-дианизидина. Причем, только используя ингибитор (амид III), удалось уточнить локализацию данной СООН-группы в активном центре пероксидазы, т.к. характер связывания ингибитора с нативной и модифицированной СМЕ-карбодиимидом пероксидазой резко различались.

ЗЛО. МОНО- И ОЛИГОСАХАРИДЫ В МЕХАНИЗМЕ ДЕЙСТВИЯ ПЕРОКСИДАЗЫ

Пероксидаза катализирует оксидазные и пероксидазные реакции окисления различных органических соединений. Активность фермента регулируется самими субстратами, проявляющи-

130

Пероксидаза в реакциях окисления медленно и быстро окисляемых субстратов

ми взаимное влияние при протекании каталитического процесса. Тогда как стабильность фермента обусловливается присутствием в среде белков и кальция.

В работах [Угарова и др., 19786; Кутузова, Угарова, 1981] показано, что стабильность пероксидазы может зависеть как от числа модифицированных групп апобелка, так и от природы модифицирующего агента и от присутствия ионов Са2+. Установлено, что стабильность ацетилированной пероксидазы в 11 раз выше, чем нативной, а добавки ионов Са2+ приводят к дополнительной стабилизации фермента. Причем отмечена аддитивность стабилизирующих воздействий ионов Са2+ и ацетилирования. При модификации большого количества функциональных групп апобелка, например, модификация 6-ти аминогрупп с помощью ТНБС приводит к дестабилизации пероксидазы [Угарова и др., 1978а; 19786].

Однако в литературе приводятся противоречивые данные относительно стабилизирующего влияния углеводов на перокси-дазу. В ряде случаев влияние их на стабильность фермента было исключено. Хотя углеводы являются составной частью фермента и способны выполнять ряд функций. В составе фермента углеводы представлены нейтральными и аминосахарами в количестве до 20% от общего веса [Shannon et al., 1966]. Разнообразие углеводов пероксидазы показывает их состав: галактоза, глюкоза, манноза, арабиноза, ксилоза, фруктоза гексозамин [Klapper, Hackett, 1965]. Все аминокислотные последовательности, выходящие на поверхность белковой глобулы фермента, имеющие состав Asn-X-Ser(Thr), являются гликозилированными (за исключением остатков 286-288) [Аммосова и др., 1997]. Молекула пероксидазы содержит восемь олигосахаридных цепочек. Центрами гликозилирования являются аминокислотные остатки с номерами 13-15, 57-59, 158-160, 186-188, 198-200, 214-216, 255-257 и 268-270 [Упоров, Егоров, 1997].

Основной функцией углеводов, входящих в состав пероксидазы является: а) защищать фермент от инактивирующего действия свободных радикалов, образующихся при протекании оксидазных и пероксидазных реакций [Угарова и др., 1981]; б) обеспечивать растворимость фермента в полярных растворителях; в) обусловливать взаимодействие фермента с мембранами и за счет этого встраивать фермент в определенные участки мембран органелл и клетки [Левашов, 1987]; г) защищать фермент от инактивирующего действия высоких температур и растворителей [Клячко и др., 1997].

131

Глава III

3.10.1. ВЛИЯНИЕ МОНО- И ОЛИГОСАХАРИДОВ НА КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПЕРОКСИДАЗЫ

Для выяснения регуляторной роли углеводов в механизме действия пероксидазы нами было исследовано влияние углеводов на каталитические свойства фермента и на его термостабильность. В качестве представителей моно- и олигосахаридов были выбраны следующие соединения: глюкоза, маннит, мальтоза, лактоза, сахароза.

Исследуя влияние моно- и олигосахаридов на каталитические свойства пероксидазы, было показано, что кинетика пероксидазного окисления о-дианизидина как в присутствии, так и в отсутствие углеводов подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен. Зависимости начальной скорости окисления о-дианизидина от его концентрации при рН 5,0 и 7,0 в присутствии всех выбранных нами моно- и олигосахаридов в координатах Лайнуивера-Берка имели вид семейства прямых, пересекающихся на оси ординат, что указывает на конкурентный характер ингибирования (рис. 57). Причем для большинства углеводов значения констант ингибирования (К.) при рН 5,0 было в 1,5—1,8 раз выше, чем при рН 7,0

(табл. 16). Это свидетельствует о том, что в кислых рН