связывание углеводов хуже, по сравнению с щелочными рН. Аналогичная зависимость отмечается и для многих субстратов пероксидазы, в частности, о-дианизидина [Лебедева и др., 1977]. Однако величины констант ингибирования значительно выше, чем значения констант связывания, определяемые для субстратов пероксидазы. Эта разница может достигать нескольких порядков, указывая на то, что углеводы хотя и могут являться субстратами пероксидазы, однако основным их предназначением, по-видимому, является участие в регулировании механизма действия фермента. Особенно это может проявлять-

l/v, мин мкМ

1/о-дианизидин 10 4, М 1

Рис. 57. Зависимости начальных скоростей пероксидазного окисления о-дианизидина от его концентрации в координатах Лайнуивера-Берка в присутствии сахарозы. Концентрации: пероксидаза— 0,081 нМ; о-дианизидин — 17,2— 172 мкМ; перекись водорода—0,64 мМ; сахароза - 1-0; 2-0,29; 3-0,58; 4-0,88 М; 0,01 М натрий-фосфат, рН 5,0.

132

Пероксидаза в реакциях окисления медленно и быстро окисляемых субстратов

Таблица 16

Величины констант ингибирования моно- и олигосахаридов пероксидазы в реакциях окисления о-дианизидина

Углевод рн К,мМ

Глюкоза 5,0 184+ 15

7,0 106+10

Маннит 5,0 365 + 20

7,0 315±24

Мальтоза 5,0 25 + 2

7,0 17+ 1

Лактоза 5,0 128+11

7,0 93 + 5

Сахароза 5,0 309 + 22

7,0 225+15

ся в растениях при завершении их роста растяжением, когда усиливается лигнификация клеточных стенок и накапливаются ингибиторы фенольной природы, способствующие возрастанию активности пероксидазы в тканях [Grierson, Covey, 1984].

3.10.2. ВЛИЯНИЕ МОНО- И ОЛИГОСАХАРИДОВ НА СТАБИЛЬНОСТЬ ПЕРОКСИДАЗЫ

Стабилизирующее влияние ионов Са2+ на пероксидазу можно объяснить образованием прочных хелатов с карбоксильными и карбонильными группами, расположенными на поверхности белковой глобулы фермента [Кутузова, Угарова, 1981].

Тогда как в случае модификации пероксидазы карбодиимидами и нуклеофилами могут модифицироваться только те карбоксильные группы фермента, которые расположены близко к поверхности и не участвуют в стабилизации пероксидазы. При этом ионы Са2+ образуют хелаты с несколькими маскированными карбоксильными группами, которые вследствие стерических затруднений не могут быть промодифицированы ни карбодиимидами, ни нуклеофилами [Рогожин,. 1984].

Для понимания роли углеводов в биокатализе, процессах сворачивании белков, обладающих каталитическим действием, исследуются ферменты не содержащие углеводные фрагменты [Lehninger et al., 1993]. При этом используются методики создания искусственно гликозилированного аналога негликозилиро-ванного фермента [Hughes, 1983]. Пероксидаза позволяет облегчить эту задачу, поскольку относится к группе природных

133

Глава III

гликозилированных ферментов [Угарова и др., 1981]. Поэтому исследование негликозилированной рекомбинантной формы пероксидазы в системе обращенных мицелл АОТ, содержащего в своем составе углеводный фрагмент, позволило установить наличие существенной стабилизации у рекомбинантной пероксидазы, которая приближалась к стабильности природной пероксидазы. В отсутствие углевода рекомбинантная пероксидаза была крайне нестабильна [Клячко и др., 1997]. Причем во всем диапазоне степеней гидротации ПАВ рекомбинантная пероксидаза была менее стабильна при инкубации в системе обращенных мицелл, чем природная пероксидаза. При этом высказывалось предположение, что только благодаря «углеводной шубе» на поверхности белковой глобулы природной пероксидазы достигается высокая стабильность фермента [Клячко и др., 1997].

Для проверки высказанного предположения нами было изучено влияние глюкозы, маннита, мальтозы, лактозы и сахарозы на термостабильность фермента. При этом кинетика термоинактивации пероксидазы как в отсутствие, так и в присутствии углеводов следовала первому порядку до 50%-ной глубины инактивации при температуре 60 °С (рис. 58). Увеличение концентрации углевода приводило к возрастанию кин. Следовательно, увеличение концентрации углевода в среде приводит к нарушению нативной конформацни фермента. Пероксидаза является одним из наиболее термостабильных ферментов, однако повышение содержания моно- и олигосахаридов в инкубационной среде во всех случаях оказывало дестабилизирующий эффект на фермент, который зависел от природы и концентрации углевода (табл. 17). Наибольшее понижение стабильности фермента отмечалось при внесении в инкубационную среду мальтозы и лактозы в присутствии которых термостабильность фермента при 60 °С понижалась в 2,1—2,7 раза (табл. 17).

134

4 3

о1—'—1—'—1—¦—'—1—'

50 100 150 200 t, мин

Рис 58. Полулогарифмические анаморфозы кинетических кривых термоинактивации пероксидазы в присутствии глюкозы при 60 °С. Концентрации: пероксидаза — 0,1 мкМ; глюкоза — 0 (1), 0,011 (2), 0,055 (3), 1,11 М (4); 0,1 М Na-фосфатный буфер, рН 7,0.

Пероксидаза в реакциях окисления медленно и быстро окисляемых субстратов

Таблица 17

Константы скорости необратимой термоинактивации (km) пероксидазы в присутствии моно- и олигосахаридов. Условия: 60 °С, 0,1 мкМ пероксидаза; 0,1 М Na-фосфатный буфер, рН 7,0

Углевод Концентрация углевода, М (%) Ц^, 10'мин' КЛ\,

Контроль 6,7

0,011 (0,2) 6,7 1,00

Глюкоза 0,055(1,0) 12,3 1,80

1,11(20,0) 21,0 3.10

0,33(6,0) 10,5 1,60

Маннит 0,49(9,0) 9,1 1,40

0,66(12,0) 8,5 1,30

0,0058 (0,2) 8,2 1,20

Лактоза 0,029(1,0) 11.7 1,70

0,58 (20,0) 18,2 2,70

0,29 (10,0) 7,3 1,10

Сахароза 0,58 (20,0) 8,5 1,30

0,87 (30,0) 5,1 0,76

0,035(1,2) 5,5 0,82

Мальтоза 0,07(2,4) 6,5 0,97

0,175 (6,0) 7,0 1,04

0,29(10,0) 14,2 2,10

0,58 (20,0) 18,4 2,70

Таким образом, проведенными экспериментами было установлено, что присутствие пероксидазы в среде с высоким содержанием углеводов понижает как активность, так и термостабильность фермента. Проявляемый эффект может являться составной частью регуляторного механизма, основанного на том, что углеводы, расположенные на поверхности глобулы фермента, проявляют стабилизирующий эффект, тогда как углеводы среды могут оказывать как ингибирующее, так и дестабилизирующее действие.

3.11. ДИНАМИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ АКТИВНОГО ЦЕНТРА ПЕРОКСИДАЗЫ

Исследование кинетики пероксидазных реакций позволило установить, что неспецифическое связывание субстратов различной природы может происходить в протяженной субстратсвязы-

135

Глава III

вающей области активного центра пероксидазы, расположенной на поверхности белковой глобулы фермента, в составе доменов которой присутствуют преимущественно гидрофобные аминокислотные остатки. Непосредственно в активном центре пероксидазы не проявляются аминокислотные остатки, содержащие SH-, ОН-, NH2- и СООН-группы.

Большие размеры субстратсвязывающей области позволяют связываться в активном центре пероксидазы неорганическим и органическим соединениям, что проявляется в неизбирательности действия фермента по от