ут конкурировать между собой за участок связывания, что проявляется в дифференцированном их окислении. При этом избирательность обусловливается природой субстрата и его сродством к участку связывания, доступностью электроннотранспортных путей к гемину.

Наличие обширной субстратсвязывающей области в активном центре пероксидазы создает условия для связывания сразу нескольким молекулам субстратов одинаковых или разных по строению, при возможности только одному из них участвовать в каталитическом процессе. Тогда как действие другого субстрата проявляется в регулировании (активировании или ингибирова-нии) ферментативной реакции. При этом реализуется принцип: один окисляется, а другой регулирует каталитический процесс. Причем разные по природе субстраты связываются в различных участках активного центра фермента или в области расположения регуляторного участка.

Исследование реакций индивидуального и совместного окисления субстратов позволило выявить наличие в активном центре пероксидазы по крайней мере двух функциональных групп, участвующих в катализе (табл. 18). Значения рК этих групп могут изменяться в определенных пределах в зависимости от природы окисляемого субстрата. Одной из них может быть карбоксильная группа [Ugarova et al., 1984; Рогожин, 1984], а другой — имидазол гистидина (His-42) [Jamada, Jamasaki, 1974; Jamada et al., 1975]. Две ионогенные группы с рК 3,5 и 5,5 были выявлены при исследовании комплексообразования амида III с пероксидазой [Рогожин, 1984]. При измерении Фурье-ИК-спектров карбонил-перок-сидазы хрена интенсивность поглощения при 1934 и 1905 см-1 зависело от рН среды. Отмечено возрастание поглощения при 1905 см-1 при ионизации группы с рК 4,0, понижающееся при ионизации группы с рК 8,7. Авторами [Holzbaur et al., 1996] выс-

140

Пероксидаза в реакциях окисления медленно и быстро окисляемых субстратов

Таблица 18

Величины рК-групп активного центра пероксидазы, выявленные при исследовании реакций индивидуального и совместного окисления субстратов

Субстраты индивидуального и совместного Показатель проявления функциональной группы Величина рК-группы

пероксидазного

окисления

Аскорбиновая 6,00

кислота IgJC 6,50

Аминазин lgKm 6,00

Аминазин и igA 5,75

ферроцианид калия lgcc 6,19

Трифтазин isk* 4,90

lg(k.,/KJ 5,60

Тиопроперазин 5,40

lg(kra,/KJ 4,70

Тиопроперазин и Смена типа ингибирования с антиконкурент- 5,5-6,0

о-дианизидин ного на конкурентный

Тиопроперазин и Смена типа активирования с бесконкурент- 6,0-6,5

строфантин G ного на смешанный

Аминазин и Смена типа ингибирования со смешанного 6,0-6,5

строфантин G на конкурентный

Трифтазин и Смена типа ингибирования с неконкурент- 6,0-6,5

строфантин G ного на смешанный

Аскорбиновая кис- Смена типа активирования со смешанного на 5,0-5,5

лота и норадрена- синергический

лин

Норадреналин и Смена типа ингибирования с конкурентного 5,0-5,5

о-дианизидин на смешанный

Аскорбиновая Проявление конкурентного типа ингибиро- 6,0-6,5

кислота и викасол вания

Викасол и Проявление конкурентного типа ингибиро- 6,0-6,5

о-дианизидин вания

Смена типа ингибирования с конкурентного 6,5-7,0

на смешанный

казано предположение, что выявленные ионогенные группы могут принадлежать аминокислотным остаткам His-42 и Arg-38 соответственно.

Методами химической модификации и ингибиторного анализа с использованием амида III подтверждено, что участки связыва-

141

Глава III

ния полярных и гидрофобных субстратов пероксидазы в активном центре фермента пространственно удалены. Причем используя водорастворимые карбодиимиды и окрашенный нуклеофил, установлено, что в участке связывания о-дианизидина располагается одна карбоксильная группа. Модификация этой СООН-группы оказывает влияние на скорость переноса электрона с донора водорода — о-дианизидина на окисленные формы пероксидазы Е, и Е2, при этом улучшается связывание окисляемого субстрата. Тогда как на процесс окисления ферроцианида, который связывается в гид-рохиноновом участке, модификация этой карбоксильной группы влияние не оказывает.

Таким образом, на основании проведенных исследований химической модификации пероксидазы можно высказать предположение, что в активном центре пероксидазы имеется несколько участков связывания субстратов. Поэтому поверхностными и доступными модификациями являются лишь те боковые функциональные группы белка, которые входят в участок активного центра фермента, предназначенного для связывания о-дианизидина. Основная часть функциональных групп пероксидазы, в том числе и группы, входящие в состав других участков активного центра, маскированы либо располагаются внутри белковой глобулы, либо защищены углеводными остатками и поэтому недоступны модифицирующим агентам. Такая структурная организация пероксидазы обусловлена особенностями механизма действия этого фермента, т.е. необходимостью защищать каталитически важные функциональные группы от действия свободных радикалов — промежуточных продуктов пероксидазного окисления субстратов, которые могут инактивировать фермент.

Пероксидазу по своему устройству можно отнести к мембранным белкам поверхностные углеводные радикалы которых способны определять специфичность связывания фермента в мембранных структурах клетки. Причем гликозилированные участки расположены достаточно далеко от активного центра пероксидазы и поэтому не влияют на протекание каталитического процесса (рис. 63). Однако углеводы среды могут регулировать каталитическую активность и стабильность фермента. При этом, если поверхностные углеводы выполняют защитную функцию, т.е. экранируют белковую глобулу от действия свободных радикалов среды, ориентируют фермент в мембранных структурах, то углеводы среды способны ингибировать пероксидазу и понижая

142

Пероксидаза в реакциях окисления медленно и быстро окисляемых субстратов

Рис. 63. Структура молекулы пероксидазы хрена с выделенными участками, соответствующими антигенными детерминантами для моноклональных антител РО( и 36F9. Черными кружками обозначены центры гликозилирования [Игнатенко и

др., 2003]..

стабильность фермента. Таким образом, совместная деятельность углеводов среды и моносахаридов, расположенных на поверхности белковой глобулы, направлена на регулирование механизма действия фермента в биогенных системах, где пероксидаза совместно с другими низкомолекулярными (аскорбиновая кислота, токоферолы, флавоноиды и др.) и высокомолекулярными (СОД, каталаза) антиоксидантами способна выполнять специализированную функцию по защите биогенных систем от действия активных форм кислорода.

143

ГЛАВА IV АНТИОКСИДАИТНАЯ СИСТЕМА РАСТЕНИЙ И ЖИВОТНЫХ

4.1. ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ В ЖИВЫХ ОРГАНИЗМАХ

Растения и животные могут существовать только в атмосфере, содержащей кислород, который обеспечивает протекание аэробных метаболических процессов в клетках, а также образование в них свободных