Биологический каталог




Структура и функции мембран

Автор В.К.Рыбальченко, М.М.Коганов

с той же плоскостью поляризации, что н поляризатор.

Поляризатор и анализатор представляют собой призмы из исландского шпата (призмы Ннколя). Если они находятся в скрещенном состоянии (т. е. анализатор повернут на 90° по отношению к поляризатору), то поле зрения микроскопа остается темным. Если между скрещенными поляризатором и анализатором поместить объект, обладающий, в свою очередь, свойством анизотропии, мы вндим его ярко светящимся на темном фоне. При вращении предметного столика микроскопа вместе с препаратом вокруг осн на 360 0 будет происходить четырхкратное просветление и погасание объекта. Оптика микроскопа не должна обладать собственным двойным лучепреломлением, обусловленным внутренним натяжением в стекле.

С помощью поляризационного микроскопа можно наблюдать ориентацию молекул липидов и измерять нх относительное содержание. При исследовании обладающего дихроизмом образца из поляризационного микроскопа уда-

4* ляют анализатор и компенсатор (объект сам выступает в роли анализатора). Вращая образец, находят угол, соответствующий наиболее точному изображению. Так можно определить ориентацию молекул в образце.

Флуоресцентная микроскопия. Интенсивность флуоресценции вещества всегда пропорциональна интенсивности падающего света. В данном микроскопе обязательно должен быть фильтр, пропускающий свет с длиной волны, соответствующей флуоресценции, но не возбуждающей свет. Этот фильтр помещается между объективом н глазом исследователя. Если флуоресценции нет, поле наблюдения будет темным. Прибавляя к объекту антитела, ковалентно связанные с флуоресцирующим красителем, например флуоресцеином, можно локализовать плазматические мембраны в отдельных клетках.

Фазово-контрастная и интерференционная микроскопия. Оба вида микроскопии основаны на возможности преобразования фаз света в различия его интенсивности, н поэтому степень потемнения исследуемого объекта зависит от его толщины и показателя преломления света, т. е. невидимые объекты делаются видимыми. Фазово-контрастная и интерференционная микроскопия имеют большое значение для наблюдения органелл живых клеток. Мембраны определяются как темные линии с ореолом по обе стороны (фазово-контрастная микроскопия) и без ореола (интерференционная микроскопия).

В кратком изложении методов непосредственного наблюдения биологических и искусственных мембран мы не останавливались на устройстве отдельных типов микроскопов. Как правило, к каждому прибору прилагается инструкция, которую необходимо изучить, прежде чем начать работу.

2.3. ВЫДЕЛЕНИЕ МЕМБРАН И РАЗДЕЛЕНИЕ НА СОСТАВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ

Установление химического состава и молекулярной архитектуры мембранных структур, структурных формул их компонентов невозможно без выделения их в чистом виде. Для этого требуется разрушить клетку так, чтобы структурная и функциональная организация мембран не нарушались. При разрушении клеток исследователи стараются применять такие материалы и вещества, которые активно не взаимодействуют с мембранными структурами. Если же такого взаимодействия избежать нельзя, то необходимо учитывать последствия его. Рис. 21. Гомогенизатор:

/ — измельчаемая ткань; 2 — тефлоновый поршень; 3 — стеклянная пробирка; 4 — гомогенат

Разрушение тканей и клеток. Свежевыде-ленную ткань измельчают, промывают водой, а затем гомогенизируют. В настоящее время предложено довольно большое количество гомогенизаторов. Наиболее широко используется гомогенизатор, представляющий собой пробирку, внутри которой вращается плотно прилегающий к ее стенкам стеклянный или тефлоновый стержень (рис. 21). Клетка разрушается благодаря силам трения. При гомогенизации очень важно подобрать нужные значения рН, состав буферного раствора и его осмотическое давление. Как правило, в качестве суспендирующей среды используют 0,25 М раствор сахарозы, к которой прибавляют хлорид магния, вещества, образующие комплексы с металлами, а также восстановители, например, дитиотреитол, 6-меркаптоэтанол и др. Полученный гомогенат процеживают, после чего он готов для центрифугирования.

Клетки микроорганизмов разрушать труднее. Для этого используют ультразвук, высокое давление, замораживание— оттаивание, обработку определенными веществами и др.

Центрифугирование. В настоящее время выделение биологических мембран в виде отдельных фракций — процесс не очень сложный. Для этого-используется множество различных типов ультрацентрифуг. (Первая ультрацентрифуга была построена Сведбергом в 1923 г. и в 1925 г. предложена для определения скорости седиментации.) В процессе ультрацентрифугирования гомогенатов фрагменты (или везикулы) мембран движутся под действием центробежной силы и распределяются по длине центрифужной пробирки. Если такое распределение не меняется во времени, считается, что фрагменты мембран достигли своего седиментаци-онного равновесия, по которому можно судить о массе и плотности фракций.

Центробежная сила, действующая на частицу, будет равна

Fn = meo2/-, (23)

а выталкивающая

FB = mahVp, (24) где т — масса частицы; г — расстояние до центра вращения; со — угловая скорость вращения ротора; V — парциальный удельный объем частицы (равный увеличению объема, вызываемого прибавлением единицы массы растворяемого вещества к раствору); р — плотность растворителя.

Кроме того, скорость движения частиц v зависит от трения частицы о молекулы растворителя. Тогда

Fn-F, coVm(l-Fp) V =-— =---, (25)

где f — коэффициент трения.

Из уравнения видно, что скорость движения частицы (v) пропорциональна величине поля центробежной силы (со2г), отношение которых дает коэффициент седиментации

и mil — То)

Таким образом, чтобы определить массу частицы, необходимо знать коэффициенты седиментации и трения. Как

V

видно из выражения 5 = ~^Г^ коэффициент седиментации

определить нетрудно. А прямое определение коэффициента трения представляет собой трудоемкую задачу. Если трение в процессе ультрацентрифугирования довольно большое, можно использовать выражение седиментационно

страница 35
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Структура и функции мембран" (2.22Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.10.2019)