Биологический каталог




Структура и функции мембран

Автор В.К.Рыбальченко, М.М.Коганов

и гель-электрофорез — см. далее) используется для исследования крупных молекул белков и пептидов.

Аффинная хроматография. Этот метод особенно часто используется в исследованиях мембран. Суть метода заключается в следующем. К нерастворимой матрице «пришивается» лиганд — небольшая молекула, которая специфически связывается с большей молекулой (макромолекулой). С этим лигандом и связывается вещество, которое необходимо выделить, при протекании через колонку исследуемого раствора.

При выборе матрицы следует иметь в виду, что необходимо исключить адсорбцию исследуемого вещества и изменение связывающих свойств лиганда. Элюирование вещества необходимо осуществлять в условиях диссоциации комплекса лиганд — вещество и исключающих разрушение выделенного вещества.

Чаще всего в аффинной хроматографии используются сефарозы, к которым «пришиваются» реагенты, связывающие мембранные белки, в том числе транспортные (лиганд— транспортируемые вещества), белки-ферменты (лиганд — ингибитор или кофактор соответствующего фермента), гликопротеины (лиганд — конканавалин А), мембраны (лиганд— гормоны), антитела (лиганд — бромциан), целые клетки некоторых опухолей (лиганд — часто конканавалин А).

В последнее время в качестве лиганда используется белок кальмодулин. Если конканавалин А — белок только растений (связывается с группами а-манозы на поверхности клетки и вызывает агглютинацию), то кальмодулин — «вездесущий» белок. Это кальциопротеин, который встречается во всех клетках эукариот и, возможно, содержится в клетках прокариот.

Кальмодулин активен только в комплексе с кальцием. Он играет существенную роль в различных биологических явлениях: клеточном делении, секреции, делении хромосом, энергетических превращениях, работе гормонов, мембранных кальциевых «насосов» и т. п. В связи с последним особый интерес представляет использование кальмодулина в качестве лиганда мембранно-связанных АТФ-аз, зависимых от ионов кальция. (Кстати, кальмодулин является и специфическим активатором Mg2+, Са2+ — АТФ-азы мембраны эритроцитных и других клеток, по-видимому, и глад-комышечных.)

Электрофорез. Под электрофорезом понимают движение заряженных частиц в растворителе под влиянием электрического поля. Так, многие компоненты мембран несут электрические заряды, их можно разделить по скорости в электрическом поле. По скорости именно потому, что последняя зависит от величины заряда, молекулярной массы, формы молекул (при постоянных условиях электрофореза). Таким образом, сила, заставляющая частицу двигаться, пропорциональна ее заряду и электрическому полю, а противодействующая сила пропорциональна скорости движения частицы, вязкости среды и ионной атмосфере частицы, экранирующей ее от действия поля.

Большинство существующих методов можно разделить на три типа.

Зональный электрофорез. При этом образец наносится на материал (носитель) в виде пятна (либо в виде линии) и помещается в электрическое поле. Следует помнить, что носитель иногда может оказывать хромато-графический эффект, который необходимо строго учитывать.

Очень часто зональный электрофорез проводят на бумаге, предварительно пропитанной соответствующим буфером. После окончания разделения в высоко- или низковольтном электрическом поле бумагу высушивают, обнару^ живают вещество (после окрашивания красителями, по флуоресценции, радиоактивности и т. п.), элюируют и определяют концентрацию на спектрофотометре.

В препаративных целях вещество добавляют на бумагу непрерывно. Лист бумаги расположен вертикально, -и движение вещества в направлении сверху вниз определяется током растворителя, а в горизонтальном — электрическим полем. По всей длине нижнего края бумаги вещество собирается в отдельные пробирки.

Если электрофорез на бумаге не дает желаемых результатов, можно после окончания электрофоретического разделения провести хроматографию под прямым углом к направлению электрофореза.

Часто бывает, что разделяемые вещества адсорбируются целлюлозой. Это ухудшает разделение, поэтому вместо бумаги в качестве носителя используют ацетат целлюлозы (гидроксильные группы целлюлозы заменены ацетатными). Отсутствие адсорбции, возможность прямого определения количества вещества на спектрофотометре (мембрана из ацетата целлюлозы прозрачна), хорошая растворимость во многих растворителях дают возможность повысить степень разделения.

Еще большего разделения можно достичь, используя в качестве носителя гели полиакрил амида и агарозы.

Полиакриламидный гель (ПААГ) — наиболее эффективный носитель для электрофореза белков, в том числе и мембранных: не удивительно, что большинство периодической литературы по белковому составу мембран посвящено электрофоретическому разделению последнего именно в ПААГ. Как правило, электрофорез в ПААГ проводят или в колонке, или на пластинках геля.

Для мембранных белков хорошие результаты определения молекулярной массы получены с использованием SDS —- ПААГ-электрофореза. Додецилсульфат натрия SDS(flCH) связывается белками, что является причиной их диссоциации. Если же SDS действует на белки в среде, где присутствует реагент, разрывающий дисульфндные связи (меркаптоэтанол, n-этилмалеимид, п-хлормеркурибен-зоат и др.), то образуются однотипные «беспорядочные» структуры комплексов SDS — белок. В таких комплексах заряд определяется в основном додецилсульфатом. (Это так потому, что количество связываемого белком SDS почти не зависит от типа белка и является величиной постоянной: 1,4—1,5 г SDS на 1 г белка.) Таким образом, подвижность белков в комплексе с SDS будет определяться только молекулярной массой.

Получаемые полосы можно идентифицировать окрашиванием (с последующим отмыванием несвязанного красителя), а количественные измерения проводят с помощью определения оптической плотности, радиоактивности и др. Имея в исследуемой смеси несколько (минимум два) белков с известной молекулярной массой, можно сравнительно легко определить молекулярную массу исследуемых белков, так как зависимость lg М от пройденного расстояния

страница 39
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Структура и функции мембран" (2.22Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.10.2019)