ельную мембранную систему. Они позволяют более детально исследовать моле-

¦138

кулярные механизмы функционирования энзимов; установить местонахождение активных центров, функциональную значимость каждой белковой субъединицы; организацию белковых субъединиц в единую систему и молекулярную структуру такой системы; установить липидное микроокружение мембранного фермента и др. Методы реконструкции позволяют разработать конструктивные решения для создания модельных биологических систем и условий их функционирования с целью применения их на практике.

К настоящему времени уже достигнуты значительные успехи в этой области: реконструирована очищенная Mg, Са — АТФ-аза из саркоплазматического ретикулума, исследованы функциональные особенности такой модельной мембранной системы и на основе этих данных предложена гипотетическая модель ее структуры. Описаны попытки реконструкции Mg, Са — АТФ-азы из мембраны эритроцитов в модельную мембранную систему, представлены результаты исследований по включению Na, К — АТФ-азы почек и субъединиц этой АТФ-азы в фосфолипидные везикулы. Показана возможность встраивания фрагментов, плазматических мембран (ПМ) неисчерченных мышечных клеток в модельную мембранную систему. Понятно, что основой методов реконструкции являются процессы слияния мембранных систем и образования межмембранных контактов.

Процессы слияния мембран широко распространены в природе и практике: клеточное деление, оплодотворение,, экзо* и эндоцитоз, образование лизосом, выделение медиаторов, липосомальная терапия, мембранная инженерия и т. д. Основная часть работ, посвященных изучению процессов слияния, проведена на искусственных мембранах. Из этих работ следует, что на первой стадии слияния происходит сближение мембранных поверхностей, которое приводит к взаимному переходу отдельных молекул, групп молекул, целых липидных кластеров из внешних монослоев. Таким образом происходит, например, встраивание липосомы в плоскую липидную мембрану (ПЛМ).

Считается, что контактный бислой представляет собой интегральную смесь структурных компонентов как липосом, так и ПЛМ. Об этом свидетельствует плавное падение сопротивления лишенных холестерина ПЛМ при добавлении в ячейку липосом, содержащих холестерин, а также появление разности поверхностных потенциалов ПЛМ, если по одну сторону ее прибавить липосомы из несущих заряд липидов. Все это свидетельствует о том, что в бислой включаются отдельные молекулы или небольшие группы, а ж целые локусы липосомальной мембраны. Предполагается, что именно наличие заряженных липидов в липосомах приводит к появлению внутримембранного электрического поля, и при приближении липосом к ПЛМ развиваются локальные дефекты структуры последних. Такое предположение наиболее вероятно, так как асимметрия поверхностного заряда снижает устойчивость бислоя и изменяет его проницаемость. Учитывая это, можно считать, что изменение структуры ПЛМ является одним из начальных этапов слияния.

Такие дефекты в структуре ПЛМ можно индуцировать различными факторами. Кроме влияния внутримембранного поля липосом структуру ПЛМ изменяют (и применяются в изучении процессов слияния) лизолипиды в виде ультразвуковой суспензии, детергенты, органические растворители, полиэтиленгликоль (ПЭГ, кстати, все чаще используется вместо вируса Сендай в процессах слияния клеток), оказывающий дегидратирующее воздействие иа мембранные структуры, осмотический градиент. Существенными в процессах слияния являются факторы, изменяющие фазовое состояние липидов (уменьшение текучести бислоя препятствует, а увеличение — способствует слиянию), морфология и размеры липосом, механическое напряжение в монослоях бислойной структуры, толщина и дипольный скачок потенциала мембраны.

Одним из самых активных стимуляторов слияния мембранных структур является кальций. Стимуляция кальцием процесса слияния искусственных мембран в первую очередь объясняется тем, что эти катионы способны к образованию связей не только с молекулами одного монослоя, но и разных мембран. Об активном связывании Са2+ кислыми фосфолипидами свидетельствует появление трансмембранной разности потенциалов на фосфатидилсерино-вых ПЛМ, а также снижение скачка потенциала и рост поверхностного давления монослоев, сформированных из кислых фосфолипидов. Последнее свидетельствует о том, что Са2+ комплексируется с фосфолипидами, нейтрализуя поверхностный заряд. Один ион Са2+ может «сшивать» четыре молекулы липида, с двумя из которых образуются координационные связи. Если Са2+ находится только снаружи липосом, происходит связывание фосфолипидов внешнего монослоя и уменьшение объема последнего, что приводит к его растяжению внутренним монослоем. Это и вызывает нарушение структуры бислоя.

. О способности кальция хелатировать как фосфатные, так и карбоксильные группы свидетельствуют и другие ис-

U0

следования. Так, показано, что наличие в среде ионов Mg2+ снижает пороговую концентрацию Са2+, необходимую для агрегационных превращений. Похоже, что Са2+ и Mg2+ образуют с бислоями два типа комплексов. Особенностью одного (при низких концентрациях Са2+) из них является сдвиг температуры фазового перехода в сторону более высоких значений. В условиях, способствующих образованию тесных контактов между фосфатидилсериновыми липосо-мами, кальций формирует второй тин комплексов с липи-дами с увеличением температуры фазовых превращений до 130 "С.

Этот процесс сопровождается упорядочением жирно-кислотных остатков, сближением липосом и освобождением тепла. Выделенная энергия диссипирует в мембранной фазе и используется на увеличение кинетической энергии молекул фосфолипидов, приводя к выходу их из бислоя и, следовательно, слиянию мембранных структур. Другие двухвалентные катионы менее эффективны как в процессах связывания с фосфолипидами, так и в фузогенных процессах.

Таким образом, необходимым условием взаимодействия искусственных мембран является локальное увеличение текучести бислоя. Все факторы увеличения текучести бислоя (внутримембранное поле, детергент