Биологический каталог




Структура и функции мембран

Автор В.К.Рыбальченко, М.М.Коганов

ткани является выделение митохондрий в холодной камере при 0—4 °С с охлажденными растворами и посудой. Это необходимо для предотвращения тепловой денатурации белков, снижения активности процессов лизиса и перекисного окисления липидов.

Отделение митохондрий от других компонентов клетки чаще всего проводят методом дифференциального центрифугирования с последующим фракционированием полученного материала в градиенте плотности сахарозы (см. 3.10).

Чистоту митохондриальной фракции можно определить различными методами: по активности ферментов-маркеров, фазово-контрастной и электронной микроскопией. Биохимический Контроль чистоты препарата основан на том, что из всех органоидов клетки только в митохондриях содержатся такие ферменты, как цитохромоксидаза или сукцинатоксидаза. В плазматических мембранах локализована 5'-нуклеотидаза, в лизосомах — кислая фосфатаза, в мембранах эндоплазматического ретикулума — глюкозо-6-фос-фатаза и т. д. Поэтому, определив удельную активность соответствующих ферментов в полученных фракциях, можно сделать заключение о чистоте препарата (см. 3.12).

С помощью фазово-контрастной микроскопии обычно устанавливают загрязнение препарата ядрами, целыми клетками или их фрагментами. Однако этот способ контроля не является идеальным — он не позволяет установить, содержит ли полученная в результате выделения митохондри-альная фракция мелкие компоненты клетки (пероксисомы, фрагменты эндоплазматического ретикулума и т. д.). Наиболее совершенным критерием чистоты выделенных митохондрий является электронно-микроскопический контроль. Однако только сочетание биохимической и электронно-микроскопической оценки полученного препарата позволяет сделать достоверный вывод о его чистоте.

Оборудование: 1. Центрифуга лабораторная рефрижераторная (ЦЛР-1). 2. Спектрофотометр (СФ-4, СФ-16). 3. Гомогенизатор Поттера — Эльвегейма с тефлоновым поршнем. 4. Набор для препарирования крыс (препаровальный столик, препаровальные иглы, скальпель, ножницы). 5. Водяная баня. 6. Лабораторная посуда (колбы, цилиндры, пипетки, пробирки). 7. Кусок полотна или марли. 8. Раз-мельчитель ткани.

Материалы: 1. Реактивы, необходимые для определения концентрации белка по методу Лоури (Лоури и сотр., 1951); см. 3.10. Реактив А: 2 %-й раствор карбоната натрия в 0,1 н. растворе едкого натра. Реактив Б: 0,5 %-й раствор CuS04-5H20 в 1 %-м растворе тартрата натрия. Реактив Фолина, который перед опытом разбавляют в два раза до содержания кислоты, равного 1 н., что проверяют титрованием щелочью по фенолфталеину. Непосредственно перед проведением определения приготовленный раствор разводят еще в два раза.

2. Реактив для перфузии печени крыс— 1 мМ раствор гидрокарбоната натрия в 5 мМ растворе хлорида кальция.

3. Среда выделения митохондрий — 0,5 М сахароза, 0,15 М калий-фосфатный буфер при рН = 7, 0,5 мМ ЭДТА, 1 % альбумина.

4. Растворы для формирования ступенчатого градиента плотности сахарозы (состав растворов см. 3.1).

5. Бычий сывороточный альбумин.

6. 10 %-й раствор трихлоруксусной кислоты.

7. 1 н. раствор едкого натра. Лабораторная работа М 5.

Выделение митохондрий из клеток печени крыс

Ход работы. Крысу декапитируют, фиксируют на препаровальном столике и вскрывают брюшную полость. При помощи канюли, соединенной резиновой трубкой с делительной воронкой, заполненной охлажденной средой пер-фузионного раствора, печень перфузируют до полного удаления видимых следов крови в вытекающей из печени жидкости. Затем извлекают печень, вырезают участки соединительной ткани и после просушивания на фильтровальной бумаге измельчают материал ножницами и пропускают через размельчитель типа поршневой мясорубки. Полученную массу взвешивают и смешивают с пятикратным (по массе) избытком среды выделения. Материал гомогенизируют путем многократного перемещения тефлоно-вого пестика сверху вниз и наоборот.

Полученный гомогенат отжимают через двойной слой полотна (нли сложенную вчетверо марлю) для удаления фрагментов ткани и центрифугируют при 2500—3000 g в течение 10 мин. Осадок, содержащий остатки ядер и обломки клеток, отбрасывают. Надосадочную жидкость центрифугируют при 15 000 g 15 мин. Осадок промывают средой выделения и центрифугируют вторично при 15 000 g 15 мин.

Для последующей очистки митохондрий осадок суспендируют в 2 мл среды выделения и. наносят на ступенчатый градиент плотности сахарозы, состоящий из следующих слоев: 7 мл 1,1 М сахарозы, 15 мл 0,8 М сахарозы, 15 мл 0,5 М сахарозы и 10 мл 0,3 М сахарозы. Эти растворы готовят на 0,15 М калийфосфатном буфере при рН = 7,0, содержащем 5 мМ ЭДТА и 1 % альбумина. Градиент готовится предварительно и выдерживается на холоде в течение 2—3 ч. Центрифугирование материала в ступенчатом градиенте проводится в бакетном роторе при 7500 об/мин в течение 45 мин.

Митохондрии, находящиеся в слоях 0,5—0,8 М сахарозы, отсасывают шприцем или специальным приспособлением для отбора фракций и осаждают при 15 000 g в течение 15 мин. Полученный осадок, митохондрий используют в биохимических и биофизических экспериментах.

В большинстве случаев необходимо охарактеризовать полученный материал либо по сухой массе, либо по содержанию белка. В первом случае часть полученной фракции высушивают и взвешивают на часовом стекле, масса которого определена заранее. Во втором случае концентрацию белка во фракции митохондрий определяют по методу Лоури.

0. 1 мл гомогената, полученного из митохондриальной фракции, добавляют в пробирку, содержащую 0,1 мл три-хлоруксусной кислоты. (Параллельно ставится контроль иа реактивы — к трихлоруксусной кислоте доливают 0,1 мл среды выделения.) Через 10 мин проводят центрифугирование материала при 5000 g в течение 5 мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок, содержащий белки, осажденные кислотой, растворяют в 1 мл 1 н. раствора едкого натра. Содержимое пробирок растирают стеклянной палочкой и помещают их в кипящую водяную баню на 15 мин. 0,1 мл полученного после нагревания со щелочью белкового гид-ролизата переносят

страница 54
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Структура и функции мембран" (2.22Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(15.09.2019)