Биологический каталог




Структура и функции мембран

Автор В.К.Рыбальченко, М.М.Коганов

в сухую пробирку. Эту же операцию проводят с контрольной пробой. В пробирки добавляют 0,1 мл раствора едкого натра и 2 мл раствора, содержащего реактивы А и Б. (Их предварительно в день проведения опыта смешивают в пропорции 10: 1.) Через 10 мин в пробирки добавляют 0,2 мл разбавленного реактива Фо-лина. Растворы встряхивают и оставляют на 45 мин в темноте для развития окраски. Содержимое пробирок помещают в кювету спектрофотометра и определяют экстинцию растворов при 750 нм. Вычитая из экстинции опытной пробы экстинцию контрольной, определяют количество белка в пробе по калибровочной кривой.

Для построения калибровочной кривой используют раствор бычьего сывороточного альбумина с известной концентрацией (0,05—1,0 мг/мл). Из основного раствора альбумина готовят серию разведений таким образом, чтобы концентрация белка в них варьировала от 0,01 до, 5 мг/мл. Определение величины экстинции этих стандартных растворов после проведения всех операций, которые изложены выше, позволяет получить зависимость между величиной экстинции раствора и содержанием в нем белка (подробнее см. 3.10).

Контрольные вопросы и задания

1. Какова функция митохондрий в клетке? 2. Расскажите о структурной организации митохондрий. 3. Как осуществляются процессы окислительного фосфорилирования в митохондриях? 4. Как проводят дифференциальное центрифугирование в градиенте плотности?

3.4. ПОЛЯРОГРАФИЧЕСКИЙ МЕТОД ИЗУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО ОКИСЛЕНИЯ

Процессы биологического окисления, сопровождающиеся поглощением кислорода и выделением углекислого газа, характеризуются различными показателями. Основными из них являются интенсивность поглощения кислорода, интенсивность выделения углекислого газа и величина дыхательного коэффициента. Последний равен отношению количества выделяемого С02 к количеству поглощаемого кислорода.

Наиболее простым методом определения параметров дыхания является разработанный Варбургом манометрический метод. Он заключается в регистрации дыхательного газообмена при помощи высокочувствительного манометра. В небольшие сосуды с боковым отростком помещают исследуемый материал и соединяют их манометрами. В боковом отростке сосуда находятся либо вода, либо щелочь, поглощающая выделяемый в процессе дыхания углекислый газ. В сосуде со щелочью изменение объема газа происходит только за счет кислорода, так как весь выделяющийся С02 поглощается щелочью. В сосудике с водой изменение объема газа происходит за счет соотношения объемов поглощаемого кислорода и выделяющегося углекислого газа. Для расчета объема С02 определяют алгебраическую сумму между данными, полученными в сосудиках со щелочью и водой.

Несмотря на возможность определения всех трех основных показателей дыхательного газообмена, манометрический метод имеет ряд существенных недостатков. Так, он обладает невысокой чувствительностью, требует сравнительно больших количеств биологического материала и является довольно громоздким. Но основной недостаток заключается в том, что им нельзя зарегистрировать процессы газообмена в начальный период инкубации материала (8— 15 мин). Между тем именно этот период характеризуется наиболее существенными изменениями параметров дыхания такого материала, как, например, суспензии митохондрий или ядер.

Поэтому в последние годы широкое распространение получил полярографический метод изучения биологического окисления, который описан в лабораторной работе № 6. Основное принципиальное преимущество этого метода заключается в возможности начинать измерения без всякого латентного периода. При сравнении . полярографического метода с манометрическим наглядно проявляются такие общие преимущества первого, как большая чувствительность, меньший расход изучаемого материала, более компактная техническая часть.

Следует подчеркнуть, что для измерения газообмена обычно применяется не классическая полярография, позволяющая получить зависимость тока, протекающего в системе, от изменяющейся разности потенциалов между электродами, а потенциостатический метод. В этом случае при фиксированной разности потенциалов между электродами имеется возможность получить зависимость величины тока, протекающего в системе, в результате разряда исследуемого вещества (например, кислорода) от времени. Однако в силу определенных традиций термин «потенциостатический метод» в биологической литературе используется редко. Кривые ток — время, полученные при фиксированном значении разности потенциалов между электродами, чаще называют полярографическими.

Оборудование: для измерения дыхания используются различные электрические схемы и конструкции ячеек, но мы ограничимся описанием наиболее простой установки с вращающимся платиновым электродом, блок-схема которой приведена на рис. 40.

Исследуемый материал (суспензию митохондрий) помещают в термостатированную плексигласовую ячейку емкостью 1—2 мл. Ячейка имеет два отверстия диаметрами 1,5 мм и 6 мм. Первое, открытое, отверстие предназначено для внесения изучаемого материала. Второе отверстие закрывается герметичной крышкой, в которой укреплен платиновый электрод и агаровый мостик, соединенный с хлор-серебряным электродом. Платиновый электрод изготавливают из платиновой проволоки диаметром 1 мм, которая запаивается в стеклянную трубку таким образом, чтобы свободный конец проволоки имел длину 3—5 мм. В верхнюю часть трубки для электрического контакта наливают ртуть, которая полностью закрывает верхний конец проволоки. В ртуть опускают провод, подключенный к поляро-

Рис. 40. Блок-схема установки для полярографического определения интенсивности дыхания в суспензии митохондрий:

/ — полярограф; 2 — самописец; 3 — серебряная пластинка, покрытая хлоридом серебра; 4 — делительная воронка, заполненная раствором насыщенного хлорида калия; 5 — резиновая трубка; 6 — агаровый мостик; 7 — отверстие для отведения митохондрий и биологически активных веществ; 8 — крышка ячейки; .9 — суспензия митохондрий; 10 — термостатированный корпус ячейки; // — ультратермостат; 12 — вращающийся платиновый электро

страница 55
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Структура и функции мембран" (2.22Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(23.09.2019)