Биологический каталог




Структура и функции мембран

Автор В.К.Рыбальченко, М.М.Коганов

д с ртутным контактом графу. Платиновый электрод вращается мотором типа ЭДГ-1 со скоростью 2000 об/мин. Для этого верхний конец стеклянной трубки электрода закрепляется в металлической муфте, соединенной передачей с. осью мотора.

Хлорсеребряный электрод состоит из серебряной пластинки площадью 50—70 см2, погруженной в делительную воронку, которая заполнена насыщенным раствором хлорида калия. Для предотвращения фоторазложения хлорида серебра на поверхности пластинки воронку окрашивают черной краской или закрывают черной бумагой. Оттянутый носик воронки через резиновую трубку соединяют с агаровым мостиком, впрессованным в крышку ячейки.

Платиновый и хлорсеребряный электроды подключаются к полярографу, соединенному с регистрирующим прибором. В работе можно использовать различные типы выпускаемых отечественной и зарубежной промышленностью полярографов, например, ннтегро-дифференцирующий по-лярограф ПЭ-312 (СССР) или полярографы LP-7, LP-60 (ЧССР). При отсутствии полярографов можно воспользоваться простейшей схемой питания электродов и регистрации тока (рис. 41).

Кроме установки, используемой для полярографического определения кислорода, для работы необходимо следующее оборудование: 1. Центрифуга лабораторная рефрижераторная (ЦЛР-1). 2. Технические и аналитические весы. 3. Гомогенизатор Поттера — Эльвегейма. 4. Шприцы на 10 мкл и 1 мл с изогнутыми иглами. 5. Лабораторная посуда (колбы, цилиндры, пипетки, пробирки, шприцы).

Материалы: 1. Препарат изолированных митохондрий, который получают в соответствии с методом, описанным в работе № 5. 2. Перед началом работы готовят реакционную среду, которая содержит 0,5 М сахарозы и 0,15 М калий-фосфатного буфера при рН = 7,0. 3. На основе реакционной среды готовят два исходных раствора, определенный объем

которых должен в ходе опытов вноситься в ячейку с митохондриями. Кон-

Рнс. 41. Принципиальная схе> ма простейшего полярографа:

/ — вольтметр типа Ф-30; 2 — ячейка с вращающимися платиновым и хлорсеребряный электродами; 3 — нагрузочное сопротивление, номинал которого подбирается в соответствии с внутренним сопротивлением ячейки; 4 — регистратор тока ячейки; 5 — делитель напряжения центрации соединений в ячейке должны быть следующими:

аденозиндифосфат (АДФ) —80 мкМ/л, никотинамид-адениндинуклеотид восстановленный (НАД-Н)—50 мкМ/л.

Для выполнения работы необходимы также: 1. Коммерческий препарат дрожжей. 2. 2 %-й раствор агар-агара, приготовленный на насыщенном растворе хлорида калия. 3. 1 %-й раствор глюкозы, приготовленный на 0,15 М растворе хлорида калия. 4. Насыщенный раствор хлорида калия.

Лабораторная работа № 6.

Полярографический метод определения интенсивности дыхания в митохондриях

Ход работы. На первом этапе выполнения работы необходимо подготовить платиновый и хлорсеребряный электроды к проведению экспериментов.

Для улучшения воспроизводимости результатов опытов, уменьшения загрязнения электрода и повышения стабильности показаний полярографа платиновый электрод необходимо покрыть полистирольной пленкой. Электрод тщательно очищают, опуская его в теплый раствор азотной кислоты в воде (1:2) на 3—5 мин. Затем промывают водой и погружают в 5 %-й раствор полистирола на четыреххлорис-том углероде. Электрод оставляют на воздухе в течение суток для полимеризации стирола либо помещают в сушильный шкаф при температуре +60 °С на 3—6 час. После нанесения полистирольного покрытия электрод хранят в сосуде с дистиллированной водой. Следует учитывать, что при полистирольном покрытии нельзя работать с растворами, содержащими 2,4-динитрофенол и азиды. При отсутствии покрытия электрода нельзя работать с цианидом, который портит его.

Для изготовления хлорсеребряного электрода в делительную воронку, заполненную раствором насыщенного хлорида калия, помещают платиновую пластинку и подключают к батарее по схеме, приведенной на рис. 42. Через сосуд пропускают ток плотностью ~5 мкА/см2 в течение 5—6 час. Покрытие должно быть плотным и слегка сероватым. Для соединения хлорсеребряного электрода с исследуемой средой используют агаровый мостик, который представляет собой стеклянную трубку диаметром 2 мм и длиной 20— 30 мм. В нижний конец трубки вставляют ватный тампон и насасывают через него 3 %-й раствор агар-агара в насыщенном растворе хлорида калия (до половины длины труб-

6 741 Рис. 42. Схема подключения к батарее серебряной пластины для образования хлорсереб-ряиого покрытия:

1 — серебряная пластинка; 2 — насыщенный раствор хлорида калия; 3 — платиновый электрод

ки). Затем мостик соединяют резиновой трубкой, наполненной насыщенным раствором хлорида калия, с оттянутым кончиком делительной воронки, в которую помещают хлорсеребряный электрод.

Подготовленный к работе платиновый электрод и агаровый мостик, соединенный с хлорсеребряный электродом, вставляют в крышку ячейки. Предварительно в ячейку наливают реакционную среду, насыщенную кислородом при атмосферном давлении. Муфту, в которую вставлен платиновый электрод, соединяют шкивом с осью мотора и включают его в сеть. Вращающийся электрод позволяет проводить достоверные измерения гораздо меньших количеств кислорода, чем стационарный, использование которого, как правило, дает сильно выраженный дрейф.

Следующий этап работы посвящен калибровке установки путем снятия вольт-амперной кривой, описывающей изменение тока в системе от величины разности потенциалов между электродами (рис. 43). Кривую снимают по точкам — начиная с нуля дискретно увеличивают разность потенциалов между электродами (Дф) на 0,1 В. Каждую из экспериментальных точек получают после того, как ток восстановления кислорода достигает стационарного значения для соответствующей величины Дф. Обычно ток устанавливается за 2—3 мин.

Из рисунка видно, что после резкого подъема кривая выходит на плато, которое представляет собой предельный ток диффузии кислорода. Плато, высота которого линейно зависит от концентрации кислорода в растворе, обычно находится в пределах от 0,45 до 0,9 В. При перв

страница 56
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Структура и функции мембран" (2.22Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(15.11.2019)