Биологический каталог




Структура и функции мембран

Автор В.К.Рыбальченко, М.М.Коганов

ом отчетливом увеличении тока после плато повыше-

Рис. 43. Вольт-амперная крнваи восстановления кислорода на вращающемся платановом электроде

io'U

i

J

0 0,2 OA 0,6 0,8&(р,В ние Аф прекращают, так как начинающееся выделение водорода изменяет микроструктуру поверхности платины. По этой причине повторная съемка вольт-амперной кривой может не дать полного повторения формы волны. Следует отметить, что плато волны может быть не строго горизонтальным, это зависит от электропроводности раствора и чувствительности установки. Основной критерий удовлетворительной вольт-амперной кривой — четкие перегибы в начале и в конце плато.

Как уже отмечалось, для определения скорости изменения концентрации кислорода в исследуемом растворе используется потенциостатический метод — за изменением тока на плато следят при фиксированном значении напряжения. Для определения кислорода обычно используют напряжение 0,65 В.

Линейность ответа установки на линейное изменение концентрации кислорода в ячейке устанавливается с помощью контрольного эксперимента. С этой целью применяются дрожжи, которые в присутствии субстрата (глюкозы) дышат с постоянной скоростью и используют весь кислород из опытной ячейки. 1 г свежих дрожжей суспендируют в 12 мл водопроводной воды и центрифугируют при 1000 g в течение 5 мин. Осадок вновь суспендируют и центрифугируют для более полного удаления наполнителя. К осадку добавляют 1 мл 1 %-й глюкозы, приготовленной на 0,15 М растворе хлорида калия. Через 10—15 мин инкубации 0,2 мл суспензии вводят шприцем в ячейку, в которую предварительно налит 1 %-й раствор глюкозы в 0,15 М хлориде калия. Кривая, описывающая изменение концентрации кислорода в ячейке в результате его потребления суспензией дрожжей, приведена на рис. 44. Как видно из рисунка, наблюдается линейная зависимость величины предельного тока от концентрации кислорода.

После калибровки установку можно использовать для определения интенсивности дыхания в суспензиях митохондрий.

Митохондрии, выделенные методом дифференциального центрифу- Мрожжи гирования и очищенные в градиенте 1

плотности сахарозы (см. 3.3), суспендируют в 2 мл среды, содержащей 0,5 М сахарозы, 0,15 М калий-

Рис. 44. Калибровочная кривая установки По кислороду с помощью суспензии дрожжей

6* фосфатного буфера при рН = 7,0. Затем 0,1—0,2 мл суспензии вводят шприцем с изогнутой иглой в ячейку. Предварительно в ячейку наливают 1 мл реакционной среды, термостатированной при 25 °С. После введения митохондрий в ячейку наблюдается поглощение кислорода вследствие процессов эндогенного дыхания. Оно происходит благодаря тому, что в суспензии митохондрий в небольших количествах содержатся необходимые для него субстраты и АДФ.

Расчет интенсивности дыхания митохондрий по поглощению кислорода легко провести, зная расстояние (в миллиметрах) от исходного уровня концентрации кислорода (250 мкМ) до нулевого. Исходя из этого можно рассчитать цену 1 мм диаграммной ленты самописца в микромолях кислорода. Зная отрезок кривой, соответствующий 1 мин, легко рассчитать скорость дыхания за единицу времени. Обычно эту скорость относят к 1 мг белка митохондрий или к 1 мг их сырой массы и выражают в микромолях кислорода в минуту на 1 мг белка. Если в процессе проведения эксперимента имеется несколько прямолинейных участков с разной скоростью потребления кислорода, то рассчитывают скорость для каждого участка.

Представленная на рис. 45 кривая описывает изменения интенсивности дыхания митохондрий в результате действия различных биологически активных соединений. После введения митохондрий в ячейку начинается потребление кислорода, которое происходит с очень низкой скоростью. В этих условиях интенсивность дыхания лимитируется эндогенными фондами субстрата и АДФ, которые после выделения митохондрий содержатся в суспензии в очень низких концентрациях. Такое состояние обмена веществ в митохондриях, когда интенсивность дыхания лимитируется низкими концентрациями субстрата и АДФ, получило назначение состояния 1 (Чане, Уильяме, 1956). Было установлено, что в состоянии 1 основным лимитирующим фактором является АДФ, так как окисление одной молекулы субстрата в дыхательной цепи митохондрий сопряжено с потреблением трех молекул АДФ, используемых для

Рис. 45. Типичная кривая интенсивности дыхания суспензии митохондрий под действи-t ем АДФ и НАД-Н 5. Состояние обмена веществ в митохондриях

Состояние Концентрация кислорода Содержание адф Содержание субстрата Интенсивность Дыхания Лимитирующий агент

1 >0 низкое низкое малая АДФ

2 >0 высокое о малая субстрат

3 >0 высокое высокое большая дыхательная цепь

4 >0 низкое высокое малая АДФ

5 0 высокое высокое 0 кислород

синтеза АТФ. Поэтому введение в суспензию митохондрий дополнительных количеств АДФ вызывает некоторое активирование дыхания. В данном состоянии (состояние 2) обмена веществ в митохондрии основным лимитирующим агентом является субстрат (табл. 5).

Наибольшая интенсивность дыхания наблюдается в том случае, когда в суспензии митохондрий содержится избыток субстрата и АДФ (состояние 3). При этом фактором, ограничивающим дыхание, является количество митохондрий в системе, т. е. количество дыхательных цепей.

Состояние 4 характеризуется дефицитом одной АДФ. Это состояние называют контролируемым, или состоянием покоя (Ленинджер, 1985). Оно характеризуется сравнительно низкой интенсивностью дыхания. Основная причина перехода митохондрий в состояние 4 связана с тем, что разность потенциалов, возникающая на сопрягающей мембране в результате переноса электронов от субстрата на кислород, не разряжается в процессах синтеза АТФ, так как АДФ в системе отсутствует (Митчел, 1968). Эта разность потенциалов . препятствует дальнейшему переносу электронов через мембрану на кислород, и он начинает потребляться митохондриями с более низко

страница 57
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Структура и функции мембран" (2.22Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.11.2019)