Биологический каталог




Структура и функции мембран

Автор В.К.Рыбальченко, М.М.Коганов

й скоростью.

Практически нулевая интенсивность дыхания наблюдается в суспензиях митохондрий, не содержащих растворенного кислорода (состояние 5).

После наблюдения за интенсивностью дыхания митохондрий, находящихся в различных метаболических состояниях, в работе проводят измерения поглощения кислорода в суспензиях митохондрий, содержащих различные субстраты и ингибиторы. На рис. 46 показана дыхательная цепь митохондрий и указаны места вхождения электронов от различных субстратов, а также пункты действия ряда ингибиторов, которые наиболее часто используются для изучения окислительного фосфорилирования. Пируват Сукцинат

1 I

Малат ФП5 ФГЬ

1 ' 1 цит. 2 цит. цит. цит. 3

ИзоцитРат-~^НАД - ФП.-Ш-КоО -6-4* с, - с - «+ а3-Ш-0

Глутамат

3-Оксиацил-КоА

ФП3 nt

КоА-производное'^* I жирной кислоты Глицерофосфат

Рис. 46. Схема дыхательной цепи митохондрий с указанием мест входа электронов:

/ — ротенон, амнтал; 2 — антимнцин а, 3 — цианид; ФП — флавопротенд; KoQ — коэнзим

Контрольные вопросы и задания

1. Опишите структуру внутренней и внешней митохондриальных мембран. 2. Расскажите о дыхательной цепи митохондрий. 3. Чем лимитируются различные состояния обмена веществ в митохондриях? 4. Какие предосторожности необходимо соблюдать для повышения стабильности показаний полярографа?

3.5. МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ХЛОРОПЛАСТОВ

Препараты изолированных хлоропластов, обладающих функциональной активностью, используются для изучения процессов переноса электронов по редокс-цепям хлоропластов, фотосинтетического фосфорилирования, транспорта ионов, конформационных изменений органоидов, а также для исследования структуры хлоропластов и функционирования углеводных циклов, обеспечивающих образование гексоз.

Для выделения хлоропластов используются различные водные и неводные среды. При необходимости исследовать компоненты углеводных циклов, локализацию минеральных элементов и ряда белков обычно используются такие неводные растворители, как петролейный эфир или смесь гек-сана с четыреххлористым углеродом и др. Однако полученные таким образом хлоропласты не могут осуществлять некоторых важнейших светоиндуцируемых процессов фотосинтеза. К их числу относятся транспорт электронов по редокс-цепям хлоропластов и сопряженный с ним перенос ионов, а также реакции синтеза и гидролиза АТФ. Это происходит в результате экстракции неводными растворителями гидрофобных компонентов фотосинтетических мембран, нарушающей протекание ряда светоиндуцированных процессов фотосинтеза.

При выделении в водной среде из хлоропластов вымывается большая часть водорастворимых компонентов, например, белки, участвующие в углеводных циклах. Поэтому такие органоиды практически не способны к реакциям восстановления СОг. В то же время в хлоропластах сохраняется функционирующая система фотосинтетических мембран. Это позволяет изучать в суспензиях изолированных хлоропластов процессы транспорта электронов, неорганических ионов, реакции фотофосфорилирования и конформационные превращения органоидов.

Для этого выделение хлоропластов производят в забу-ференных водных средах (рН=6,9—8,0), содержащих в качестве изотонического элемента 0,3—0,35 М раствор хлорида натрия или растворы 0,3—0,5 М сахарозы. В среду выделения обычно вводят также некоторые неорганические ионы, необходимые для сохранения функциональной активности хлоропластов (магний, фосфат), а также восстановители (аскорбат), сульфгидрильные соединения (цистеин, глутатион), стабилизирующие факторы (альбумин, фиколл, декстран, полиэтиленгликоль).

На первом этапе выделения хлоропластов листья зеленых растений размельчают в соответствующей среде выделения, разрушая оболочки клеток. Затем гомогенат центрифугируют со скоростями, позволяющими отделить фракцию хлоропластов от других, более тяжелых и более легких компонентов клетки. Этот метод, основанный на последовательном разделении гомогената на фракции, осаждаемые при определенных значениях величины силы тяжести, получил название метода дифференциального центрифугирования.

Для последующего разделения суспензии хлоропластов на фракции, отличающиеся по размерам органоидов и их целостности, проводят разделение материала в ступенчатом или линейном градиенте плотности сахарозы, фиколла или хлорида цезия. При этом органоиды распределяются после центрифугирования в градиенте плотности в соответствии со своей плотностью.

Оборудование: 1. Центрифуга лабораторная рефрижераторная (ЦЛР-1). 2. Спектрофотометр (СФ-4, СФ-16). 3. Микроскоп (МБС-1). 4. Технические и аналитические весы. 5. Гомогенизатор. 6. Фарфоровая ступка с пестиком. 7. Лабораторная посуда (колбы, цилиндры, пробирки, пипетки, шприцы. 8. Кусок полотна или марли. 9. Стеклянные фильтры № 2, № 3. Материалы: 1. Среда выделения, содержащая 0,4 М сахарозы, 50 мМ хлорида натрия, 50 мМ трис-HCl буфера при рН=7,8 и 2 мМ хлорида магния. В состав среды желательно ввести 0,1 %-й раствор альбумина.

2. Растворы для формирования градиента плотности сахарозы: а) 0,8 М сахарозы, 50 мМ хлорида натрия, 50 мМ трис-HCl буфера при рН=7,8, 2 мМ хлорида магния; б) 1,0 М сахарозы, 50 мМ хлорида натрия, 50 мМ трис-НС1 буфера при рН=7,8, 2 мМ хлорида магния; в) 1,5 М сахарозы, 50 мМ хлорида натрия, 50 мМ трис-HCl буфера при рН=7,8, 2 мМ хлорида магния.

3. 100 %-й и 80 % -й ацетон.

До начала работы необходимо вырастить 12—15-дневные проростки гороха или шпината. Для этого семена замачивают в питательной среде Кнопа, приготовленной из заблаговременно подготовленных растворов отдельных солей: а) 1 % Ca(N03)2-4H20 —8 мл/л; б) 5% КН2Р04 —

4 мл/л; в) 10% KN03 —2 мл/л; г) 1 % M?SO4-7H20 — 2 мл/л; д) 10 % КС1— 1 мл/л; е) 0,8 % цитрата железа —

5 мл/л.

Затем семена помещают в чашки Петри и выдерживают в темноте при комнатной температуре в течение 2—3 дней, периодически смачивая семена новыми порциями среды Кнопа. Проросшие семена высаживают в ванночки, заполненные питательной средой, и выращивают при искусственном освещении 12—1

страница 58
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Структура и функции мембран" (2.22Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(15.12.2019)