Биологический каталог




Структура и функции мембран

Автор В.К.Рыбальченко, М.М.Коганов

о флуоресценция этих красителей в сравнительно широком диапазоне значений рН линейно зависит от кислотности среды» Так как изменения флуоресценции можно регистрировать оптическими методами, чувствительность и быстродействие которых достаточно высоки, можно зарегистрировать очень малые величины сдвигов рН с хорошим временным разрешением.

Однако при использовании рН-индикаторов следует учитывать возможность артефактов в результате связывания красителей с мембраной, возможность фотохимических и редокс-превращений красителей и, что весьма существенно, наличие светоиндуцированных изменений абсорбции самих хлоропластов в полосе поглощения красителей.

В то же время процессы Н+-транспорта можно легко регистрировать по сдвигу рН среды в незабуференных суспензиях хлоропластов потенциометрическим методом (Ни-шимура, Ито, Чане, 1962; Нойман, Ягендорф, 1965; Молот-ковский, Дзюбенко, 1970) с использованием стеклянного электрода. Хотя этот метод не дает информации о процессах Н+-транспорта внутри тилакоида, можно получить косвенные данные о сдвиге рН внутри фотосинтетической мембраны, используя «вывернутые» субхлоропластные частицы, полученные в результате ультразвуковой обработки хлоропластов (Аидерсон, Акелунд, 1978).

В последние годы потенциометрический метод регистрации сдвигов рН в суспензиях хлоропластов был разработан для определения активности циклического фотофосфорили-рования (Чане, Нишимура, 1967), нециклического фотофос-форилирования, сопряженного с восстановлением феррици-анида калия, скорости реакции Хилла.

Потенциометрический метод определения активности Н+ основан на измерении электродвижущей силы (ЭДС) гальванического элемента, состоящего из двух электродов — индикаторного электрода, потенциал которого зависит от активности Н+ исследуемого раствора, и электрода сравнения с устойчивым и известным потенциалом (Бейтс, 1968).

Электродами сравнения при измерении рН обычно служат каломельный или хлорсеребряный. В качестве индикаторного электрода могут применяться водородные, хингид-ронные и металлоксидные электроды. Однако наиболее удобным для измерений в суспензиях хлоропластов является стеклянный электрод, состоящий из трубки, которая заканчивается тонкостенным полым шариком из специального стекла. Внутренняя часть электрода заполнена раствором с определенной концентрацией Н+, в который помещен хлорсеребряный электрод. Шарик из специального стекла проницаем для Н+ и способен к обмену ионов натрия или лития, входящих в его состав, на Н+ из наружного раствора. Поэтому на внутренней и наружной поверхностях шарика устанавливается ионное равновесие, определяющее потенциал обеих поверхностей. Так как состав раствора внутри шарика остается постоянным, потенциал стеклянного электрода является функцией величины рН исследуемого раствора. Между поверхностью стекла и исследуемым раствором разность потенциалов Е определяется активностью Н+ в растворе:

RT RT ? = -г1пан+ = 2,3-ГрН, . (47)

где R — универсальная газовая постоянная; Т — температура растворов, °К; F — число Фарадея; ан+ — активность Н+ в растворе.

Система, состоящая из двух электродов, образует гальванический элемент (рис. 48). Если потенциалы электродов различны, в цепи возникает ЭДС, равная разности электродных потенциалов. Суммарная ЭДС зависит от величиРис. 48. Гальванический элемент, состоящий из стеклинно-го и хлорсеребряного электродов:

/ — хлорированная проволока из серебра: 2, 8 — стеклянный корпус хлорсеребряного электрода; 3 — насыщенный раствор хлорида калия: 4 — асбестовая нить-контакт; $ — исследуемый раствор; 6 — шарик нз Н+-селективного стекла; 7 — раствор соляной кислоты

Рис. 49. Динамика светоинду-цированных изменений рН в суспензии изолированных хлоропластов:

/ — динамика сдвига рН в суспензии, не содержащей компонентов реакции синтеза АТФ; 2 — динамика сдвига рН в присутствии АДФ и неорганического фосфата; стрелка вверх — включение света; вниз — окончание освещения

ны рН раствора линейно. Измеряя ЭДС с помощью чувствительного милливольтметра, определяют величину рН исследуемого раствора.

Поместив индикаторный электрод и электрод сравнения в суспензию хлоропластов, можно измерить величину светоиндуцированного сдвига рН. Ои вполне обратим (рис. 49) — Н+, поглощенные на свету тилакоидами, в темноте диффундируют в наружную среду. В результате трансмембранный градиент рН, образовавшийся на свету, в темноте выравнивается. Однако обратимость сдвига рН наблюдается только в том случае, если в суспензии отсутствуют компоненты, необходимые для протекания реакции фотофосфо-рилирования,— АДФ и неорганический фосфат. Если среда содержит эти компоненты, амплитуда светоиндуцированного сдвига рН в суспензии хлоропластов увеличивается и измерения рН становятся частично необратимыми (рис. 49). В этих условиях помимо обратимого в темноте поглощения Н+, которое наблюдается в отсутствие АДФ и иеорганичеРнс. 50. Блок-схема установки для регистрации светонндуцнрованных сдвигов рН в суспензии изолированных хлоропластов:

/ — стеклянный электрод; 2 — хлорсеребряный электрод; з — ванночка для термостатнровання суспензии; 4 — суспензия хлоропластов в инкубационной среде; 5 — магнитная мешалка; 6 — рН-метр рН-121; 7 — усилитель постоянного тока И-37; 8 — самописец Н-37; Я — ультратермостат У-10; 10 — жидкостный тепловой фильтр; Л — светофильтр, пропускающий свет с длиной волны ^650 им; 12 — источник света

ского фосфата, происходит необратимое поглощение Н+, сопровождающее реакцию синтеза АТФ,

АДФ3- + НРО2^ + пН+ ->• АТФ4- + Н20. (48)

Оборудование: для регистрации светоиндуцированных сдвигов рН в суспензии хлоропластов используют установку, блок-схема которой приведена на рис. 50. Установка состоит из осветителя, ячейки, в которую погружены стеклянный и хлорсеребряный электроды, рН-метра и комплекта аппаратуры, обеспечивающей достоверную регистрацию сдвига рН в суспензии порядка Ю-3 ед. рН. Источником света служит проекционная кинолампа, создающая освещенность около 40 ООО. люкс. Между

страница 60
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Структура и функции мембран" (2.22Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(15.11.2019)