Биологический каталог




Структура и функции мембран

Автор В.К.Рыбальченко, М.М.Коганов

источником света и ячейкой помещается светофильтр, имеющий определенную полосу пропускания, и водный экран, который поглощает большую часть теплового излучения источника света.

Цилиндрическая ячейка объемом 5—10 мл находится в термостатированной ванночке, Перемешивание суспензии осуществляется магнитной мешалкой. Для устранения наводок ячейка помещена в металлический экран.

При использовании в качестве измерительного прибора рН-метра ЛПУ-01 можно повысить его чувствительность и вместо комплекта регистрирующей аппаратуры пользоваться самописцем КСП-4. Повышение чувствительности усилителя ЛПУ-01 достигается заменой выходного сопротивления R-72 (50 Ом) на 400; сопротивление R-71 шунтировано сопротивлением 15 кОм. В результате вся шкала самописца соответствует 0,1—2,0 ед рН, а цена деления 1 см на диаграммной ленте — 0,005 ед рН (Гавриленко, Ладыгина, Хандобина, 1975).

Помимо установки для выполнения работы необходимо следующее оборудование: 1. Центрифуга лабораторная рефрижераторная (ЦЛР-1). 2. Спектрофотометр (СФ-4, СФ-16). 3. Технические и аналитические весы. 4. Гомогенизатор. 5. Микрошприцы на 1 мкл и 10 мкл. 6. Лабораторная посуда (колбы, цилиндры, пипетки, пробирки).

Материалы: перед началом работы необходимо выделить препараты изолированных хлоропластов методом дифференциального центрифугирования. Полученные после разделения в градиенте плотности сахарозы фракции хлоропластов ресуспендируют в незабуференной среде инкубации следующего состава: 0,4 М сахарозы, 50 мМ хлорида натрия, 2 мМ хлорида магния и 0,02 мМ феназинметасуль-фата (рН среды инкубации должен составлять 7,6—8,0 ед рН). Соответствующую фракцию хлоропластов центрифугируют при 2500 об/мин и 0...+4 °С, осадок после гомогенизации разводят в 2—3 мл инкубационной среды.

Для выполнения работы на основе этой среды готовят ряд исходных растворов, определенный объем которых должен в ходе опытов вводиться в ячейку с хлоропластами. Концентрации соединений в ячейке должны быть следующие: а) адёнозиндифосфат — 0,4 мМ/л; б) КН2Р04 — 2,5 мМ/л; в) 3(3,4-дихлорфенил)-1,1-диметилмочевина — 5 мкМ/л; г) я-трифторметоксикарбонилцианидфенилгидра-зон — 2 мкМ/л; д) метиламин — 7,5 мМ/л.

Лабораторная работа № 8.

Определение светоиндуцированных сдвигов рН

в суспензии хлоропластов, не содержащей компонентов

реакции синтеза АТФ

Ход работы. На первом этапе работы следует определить концентрацию хлорофилла в препаратах изолированных хлоропластов.

Затем ячейку заполняют инкубационной средой н вносят в нее суспензию хлоропластов (эквивалентную 40—60 мкг хлорофилла), которая получена после дифференциального центрифугирования. Эта «суммарная» фракция хлоропластов и компоненты инкубационной среды обладают определенной буферной емкостью. Поэтому для последующего расчета светоиндуцированных изменений концентрации Н+ в опыте предварительно необходимо определить, на сколько единиц сдвигается рН среды при добавлении известного количества Н+ в раствор. Для этого определенное количество соляной кислоты, соответствующее 0,01—0,10 мкМ Н+, микрошприцем добавляют в ячейку, содержащую суспензию хлоропластов. Поскольку буферная емкость существенно зависит от количества введенных в ячейку хлоропластов и их целостности, титрование суспензии необходимо проводить в каждом эксперименте. Все предварительные операции с хлоропластами, включая определение буферной емкости суспензии, проводят в темноте.

Динамика сдвига рН в суспензии хлоропластов при освещении ячейки светом с длиной волны ^650 нм приведена на рис. 45 (кривая 1). В суспензии, не содержащей АДФ и неорганического фосфата, светоиндуцированные сдвиги рН полностью обратимы при выключении света. Как уже отмечалось, кривая изменения рН является суперпозицией двух процессов — сопряженного со светоиндуцированным переносом электронов по редокс-цепям хлоропластов транспортом Н+ из инкубационной среды внутрь тилакоидов и происходящей в темноте диффузией поглощенных на свету Н+ в наружную среду через тилакоидную мембрану.

Для определения величины обратимого светоиндуциро-ванного процесса поглощения Н+ хлоропластами достаточно знать буферную емкость суспензии, амплитуду изменения рН и содержание хлорофилла в опытной смеси. На основе этих величин определяют число микромолей Н+, поглощенных в опыте в расчете на 1 мг хлорофилла.

На основании тех же данных можно рассчитать ориентировочную величину градиента рН, возникающего на мембране тилакоида при освещении. Для этого можно воспользоваться следующей формулой:

-^ = -^- (49)

рнвн 'нар

где рНнар — величина сдвига рН в суспензии хлоропластов при освещении; рНвн — величина сдвига рН во внутритила-кондном пространстве; Vsa— суммарный объем внутрити-лакоидного пространства; согласно работам Барбера (1973), Хелдта и сотр. (1973), в расчете на 1 мг хлорофилла в суспензии внутритилакоидное пространство занимает объем 3,3 мкл; Унар — объем, занимаемый в ячейке инкубационной средой и суспензией хлоропластов.

Следует помнить, что формула (49) не учитывает возможного различия в значениях буферной емкости наружной среды и раствора, находящегося внутри тилакоидов. Лабораторная работа М 9. Определение светоиндуцированных сдвигов рН в суспензии хлоропластов в присутствии АДФ и неорганического фосфата

Ход работы. В инкубационную среду с суспензией хлоропластов вводят АДФ и неорганический фосфат. При освещении суспензии хлоропластов, содержащей компоненты реакции фотофосфорилирования, наблюдается сдвиг рН, существенно отличающийся от светоиндуцированного сдвига рН, зарегистрированного в отсутствие АДФ (рис. 43, сравните кривые 1 и 2). Так, амплитуда сдвига рН значительно увеличивается. При выключении света рН раствора снижается, не достигая, однако, исходного уровня.

Для расчета количества синтезирующейся на свету АТФ необходимо знать буферную ёмкость инкубационной среды, время установления стационарного уровня рН, содержание хлорофилла в пробе и значение коэффициента п в уравнении (48), где п характеризует стехиометрич

страница 61
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Структура и функции мембран" (2.22Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(15.11.2019)