Биологический каталог




Структура и функции мембран

Автор В.К.Рыбальченко, М.М.Коганов

рН-электрода; 10 — хлорированная проволока, изготовленная нз серебра

тивного стекла. Трубку запаивают с одной стороны плоской мембраной из специального Н+-селективного стекла. Для изготовления электродов необходи- j 5 мо, чтобы толщина этой мембраны была соизмерима с длиной волны видимого света. Она должна давать интерференционную картину. Только в этом случае электрод может иметь высокое быстродействие.

Затем тру_бку заполняют раствором электролита (0,1 М хлорида натрия в 0,5 М ацетатном буфере при рН=4,6), в который погружают хлорированную проволоку из серебра. Пространство между проволокой и стенками трубки герметизируют эпоксидной смолой. Электроды калибруют по буферным растворам в диапазоне значений рН 4—9 и отбирают те, которые обладают идеальной Н+-функцией.

Сопротивление таких электродов обычно составляет около 106 Ом-см2

Тонкослойная ячейка. Опыты проводят в тонкослойной ячейке с прозрачным дном, конструкция которой приведена на рис. 53. Суспензию хлоропластов вносят в зазор между днем ячейки и плоской поверхностью Н+-се-лективной мембраны торцового рН-электрода. Желательно, чтобы толщина зазора составляла 20—40 мкм. Это позволяет свести к минимуму влияние диффузионных процессов и обеспечить однородное освещение суспензии.

В корпус ячейки вставляют хлорсеребряный электрод сравнения, который контактирует с находящейся в ячейке суспензией хлоропластов.

Быстродействующий усилитель. Для измерения разности потенциалов, возникающей между стеклянным и хлорсеребряный электродами при освещении хлоропластов световым импульсом, необходим высокочувствительный усилитель напряжения. Это связано с тем, что Рис, 54. Принципиальная схема двухкаскадиого усилителя напряжения, собранного на базе интегральной микросхемы К284УД1А. Пояснения в тексте

одиночная вспышка обычно индуцирует сдвиг рН в суспензии порядка 10-3 ед рН, что соответствует изменению потенциала стеклянного электрода всего на 60 мкВ.

В качестве измерительного прибора можно использовать усилители с высоким входным сопротивлением (>1012 Ом) и малым временем отработки сигнала (t^10~4 с). Схема одного из возможных вариантов такого усилителя приведена на рис. 54. Этот двухкаскадный измерительный прибор собран на базе интегральных микросхем К284УД1А, параметры которых описаны В. М. Головиновым и В. С. Даниловым (1974).

Первый каскад представляет собой повторитель напряжения, второй — инвертирующий усилитель с масштабным коэффициентом передачи. Повторитель (преобразователь импеданса) имеет высокое входное сопротивление (не менее 1014 Ом), которое определяется качеством монтажа схемы. Он служит для согласования высокоомного датчика (рН-электрода) с низкоомным входом усилителя. На выходе повторителя имеется система, позволяющая скомпенсировать разность потенциалов, связанную^ наличием ЭДС между стеклянным и хлорсеребряный электродами при всех исходных значениях рН инкубационной среды (за исключением рН изопотенциальной точки, зависящей от типа используемого Н+-селективного стекла). Компенсация этой ЭДС позволяет избежать эффектов насыщения усилителя при больших коэффициентах передачи.

На входе усилителя имеется также Т-образный фильтр, эффективно уменьшающий высокочастотные шумы в системе.

Регистрирующий прибор, собранный по схеме, приведенной на рис. 50, позволяет измерять изменения разности потенциалов между электродами порядка 10 мкВ Рис. 55. Схема вспомогательной цепи для подачи временной экспоненциальной развертки на Х-пластииы осциллографа ца х~, или Jf-вход двухкоординатиого самописца

(— 10-4 ед рН) с быстродействием 2-10-5 с.

Запись сигнала. Для записи индуцированного вспышкой сдвига рН целесообразно использовать экспоненциальную временную развертку. Такой способ записи сигнала необходим для регистрации полной кривой сдвига рН, перекрывающей широкий диапазон времени. На Х-пластины осциллографа со вспомогательной RC-цти (рис. 55) подают развертку по закону

U= 1 — ехр (—pt), (53) где р =

Вспомогательная цепь временной развертки должна быть синхронизирована со вспышкой, чтобы сигнал на Х-пластины осциллографа поступал одновременно с освещением хлоропластов световым импульсом. В результате на экране осциллографа регистрируется индуцированный вспышкой сдвиг рН в интервале от ^—0 до t-*-oo на конечном отрезке абсциссы.

Параллельно с осциллографом к выходу усилителя подключается быстродействующий самописец, на ленте которого фиксируется сдвиг рН в линейной временной развертке.

Источник света. Изменение уровня рН в суспензии хлоропластов, помещенной в тонкослойную ячейку, вызывают либо одиночной вспышкой импульсной лампы (например, ИФК-120), либо серией вспышек, наносимых с интервалом в 5 с. Длину волны светового импульса можно изменять, пользуясь набором светофильтров, которые размещают между вспышкой и прозрачным дном ячейки.

Кроме установки для проведения экспериментов необходимы то же оборудование и материалы, что и для работ 8, 9, 10, а также я-трифторметоксикарбонилцианидфенил-гидразон (ФКФ), диурон и метиламин (МА). Лабораторная работа № 11. Определение быстродействия стеклянного электрода

Ход работы. С целью определения быстродействия стеклянного электрода в зазор тонкослойной ячейки вносят смесь ФМС (200 мкМ) и окисленного цитохрома с (1 мМ), приготовленную на инкубационной среде следующего состава: 0,4 М сахарозы, 50 мМ хлорида натрия, 2 мМ хлорида магния, 0,1 % альбумина (рН среды доводят раствором гидроксида натрия до 7,8—8,0 ед рН). Ячейку со вставленными в крепления корпуса электродами помещают в металлический экран, снижающий уровень наводок. Затем регистрируют сдвиг рН, вызываемый вспышкой света с длиной волны ^430 нм, в результате реакции (52) между ФМС и цитохромом с. По постоянной времени свето-индуцированного процесса подкисления среды в ходе фотохимической реакции определяют быстродействие рН-элек-трода. Оно не должно превышать 5 мс.

Перед началом экспериментов с хлоропластами необходимо также измерить точный наклон функции «рН-пот

страница 64
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Структура и функции мембран" (2.22Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(09.12.2019)