сты необходимо выдержать в темноте в ячейке 10—15 мин при потенциале электрода —0,4 В. За это время фоновый ток, первоначально, в момент включения, достигающий значительной величины (~5-10~5 А), успевает снизиться до указанного выше значения (~5-10~7 А) и далее практически не меняется.

Хлоропласты в ходе опытов освещают как одиночными световыми импульсами, так и сериями вспышек (л^

^650 нм), наносимых с интервалом в 5 с. Действие одиночного светового импульса на суспензию хлоропластов, из которой предварительно удален

Рис. 65. Динамика выделения кислорода, индуцированного в суспензии хлоропластов световым импульсом:

Ф

б

О 0,5 Igp

а — полная кривая выделения кислорода, записанная в экспоненциальной временной развертке; б — амплитудно-частотный спектр, вызываемых вспышкой «элементарных» процессов кислородного обмена Рис. 66. Кинетика выделения кислорода в суспензии хлоропластов под действием светового импульса:

а — контроль; б — хлоропласты, подвергнутые воздействию осмотического шока

О

0,2 OA 0,6 0,8 1,0 X=1-exp(-pt) р=1,15сч ¦

растворенный в воде кислород, вызывает временное увеличение тока в системе (рис. 65). Обработка этой кинетической кривой показывает, что она представляет собой суперпозицию двух экспонент с характеристическими временами ~ 0,4 с и ~8,3 с. Первая экспонента соответствует процессу выделения кислорода хлоропластами, вторая — выработке выделившегося кислорода из объема ячейки. Скорость этого второго процесса определяется диффузией кислорода из объема рабочей камеры к электроду.

Как видно из рисунка, ток на электроде после нанесения вспышки увеличивается не сразу. Росту тока в системе предшествует некоторый латентный период. На кривой, полученной в тех же условиях, но записанной в другом масштабе — при большом значении параметра р, эта начальная задержка проявляется более отчетливо (рис. 66)1. Время задержки для качественно выделенных препаратов хлоропластов, как правило, составляет 150—200 мс. После инкубации хлоропластов в гипотонической среде (среда выделения без сахарозы) оно сокращается до 20—40 мс вследствие осмотического шока, нарушающего замкнутость тилакоидных мембран.

Лабораторная работа № 17.

Определение количества электричества, расходуемого на восстановление кислорода, выделяющегося из суспензии хлоропластов под воздействием одиночного светового импульса

Ход работы. Для определения количества электричества, расходуемого на восстановление выделившегося кислорода, можно использовать метод весового интегрирования. Зная рабочий объем ячейки, концентрацию хлорофилла в суспензии и принимая молекулярную массу пигмента равной ~900, можно рассчитать содержание хлорофилла в ячейке, а также оценить процент числа цепей переноса электронов, в которых вспышка вызывала редокс-реакцию.

Ниже приведен пример такого расчета, сделанный на основании обработки кривой, представленной на рис. 67. -1,0^-

Выделение 02 в среду

Рис. 67. Кинетика выделения кислорода в суспензиях хлоропластов, 0,6 Х=1-руП-/п^ пРеДваРительно освещенных 50 све-j_уг~лР;> товыми импульсами:

а — полная кривая выделения кислорода, записанная в экспоненциальной временной развертке; б — амплитудно-частотный спектр вызываемых вспышкой «элементарных» процессов кислородного обмена (сплошные линии). Штрихом показаны «элементарные» процессы в контрольной системе

® 6

0,5 Igp

Количество электричества, расходуемого на восстановление кислорода, составляет ~2,5Х XIО-8 К- При объеме рабочей камеры ячейки 3,24-10~3 мл (диаметр дискового золотого электрода — 0,65 см2; высота зазора — 50 мкм) и концентрации хлорофилла в суспензии 300 мкг/мл содержание хлорофилла в ячейке составляет ~1,Ы0-9 М. Действие одиночной вспышки вызывает перенос одного электрона примерно на 4000 молекул хлорофилла. Учитывая, что число молекул хлорофилла, приходящихся на одну электрон-транспортную цепь, оценивается обычно величиной 300—500 (Андерсон, 1975; Витт, 1979), можно заключить, что одиночный световой импульс в данном случае вызывает однократную редокс-реакцию примерно в 10 % цепей переноса электронов, локализованных на мембранах хлоропластов.

Следует подчеркнуть, что выделение кислорода под действием одиночного светового импульса наблюдается лишь в том случае, если его длительность ^5 мс (Уиттингем, Браун, 1958).

Лабораторная работа № 18. Исследование выделения кислорода при освещении суспензии хлоропластов серией световых вспышек

Ход работы. Эксперименты проводят с освещением суспензии хлоропластов серией вспышек. Ячейку с хлоропластами освещают 40—50 световыми импульсами с интервалом в 5 с. После 10 мин темновой адаптации наносят одиночную вспышку и регистрируют выделение кислорода. При этом, как правило, наблюдается резкое изменение динамики выделения кислорода (см. рис. 67) по сравнению с контролем (см. рис. 65). В амплитудно-частотном спектре кривой сохраняется только первый, самый быстрый, процесс выделения кислорода и появляются два новых процесса —3' и 2'. Один из них (характеристическое время ~2 с) сопровождается уменьшением тока в системе, ниже фонового уровня, а второй (t ~ 6,3 с) возвращает систему к уровню фона. Эти процессы нельзя связывать с расходованием кислорода, поскольку его концентрация в ячейке в стационарных условиях равна нулю, а ток в ходе реакции 3' падает до величины, меньшей исходного уровня, соответствующего фоновому току, обусловленному, как указывалось, восстановлением кислорода на периферии электрода. Очевидно, протекание процесса 3' связано с расходованием на электроде какого-то вещества (обозначим его R), образующегося при повторном освещении хлоропластов в анаэробных условиях. Это соединение должно быть довольно сильным восстановителем, поскольку оно способно окисляться в нейтральной среде при потенциале —0,4 В. Кроме того, оно должно быть водорастворимым, так как в противном случае оно не попадало бы на электрод.

Таким образом, наблюдаемая после многократного действия вспышек реакция хлоропластов