Биологический каталог




Структура и функции мембран

Автор В.К.Рыбальченко, М.М.Коганов

сец с временной разверткой, например, графопостроитель Н306, комплект измерительной аппаратуры И-37, Н-37 и т. п.

Блок поляризации рабочего электрода должен обеспечивать как ступенчатое, так и линейное изменение его потенциала. При диаметре микродискового электрода до 100 мкм целесообразно использовать двухэлектродную схему поляризации. В этом случае для задания поляризации можно использовать блок развертки потенциостата П-5827 м.

При выполнении работы необходимо также следующее оборудование: 1. Центрифуга лабораторная. 2. Гомогенизатор Поттера — Эльвегейма. 3. Лабораторная посуда (колбы, цилиндры, пипетки, пробирки, шприцы). 4. Баллон с аргоном.

Материалы. Перед проведением работы из колб, содержащих культуру мнкроводорослей типа «Сценедесмус» или «Хлорелла», отбирают определенное количество материала, центрифугируют его при 3000 g в течение 3—5 мин. Осадок ресуспендируют при помощи гомогенизатора в среде Арнона (рН=6,7), имеющей следующий состав:

Са+2 —1,0 мг-экв/л Fe+3 — 4 мг/л (в виде Fe-ЭДТА) Mg+2 — 2,0 » Мп+2 — 0,5 »

К+ —22,8 » Си+2 —0,02 »

NO7 — 20,0 » Zn+2

В

Мо

Р0-з — 6,0 SO-2 — 2.° »

— 0,05

— 0,5

— 0,001

— 0,005

С1- — 1,0 »

После ресуспендирования концентрацию клеток доводят до 10—12 млн. на 1 л среды.

Лабораторная работа № 20. Изготовление микродискового электрода и снятие поляризационных кривых (I—ф) восстановления растворенного кислорода

Ход работы. Первый этап выполнения работы предусматривает изготовление микродисковых электродов. Исходным материалом служат толстостенные капилляры из обычного стекла длиной 3—5 см и внутренним диаметром

1— 1,5 мм. Они тщательно обезжириваются и высушиваются. Капилляры должны иметь удлиненную конусообразную форму, что в значительной степени облегчает впаивание и шлифовку рабочей поверхности. Внешний диаметр торца оттянутой части капилляра не должен превышать

2— 3 мм (рис. 72).

Обезжиренный отрезок золотого микропровода длиной 2—2,5 см вводится в тонкую часть капилляра, а затем капилляр устанавливается в аппарат для вытягивания микропипеток (типа МЭ-3), как это показано на рис. 72, б. Нагревательная спираль изготавливается из нихромовой проволоки сечением 0,5—0,9 мм. Диаметр спирали подбирается эмпирически, но она не должна ка-

Рис. 72. Схема изготовления микродискового электрода:

а — стеклянный капилляр с золотым микропроводом; б— впаивание микропровода; в — конструкция микродискового электрода; / — отрезок золотого микропровода; 2 — стеклянный капилляр; 3 — нихромовая спираль; 4 — место дли спая золотого мнкропровода с медиым токоподводом; 5 — токоподвод; 6 — металлический колпачок, закрывающий капилляр саться поверхности стекла. При пропускании тока через нихромовую спираль в зоне нагрева стекло расплавляется и заливает микропровод. После того, как стекло покроет всю поверхность микропровода в зоне нагрева, ток отключают. Затем в запаянный капилляр с открытого конца медным проводом диаметром 0,5—0,9 мм проталкивается небольшой кусочек легкоплавкого металла (индня или галлия) до соприкосновения с золотым микропроводом. Прогревая капилляр в пламени спиртовки, следует добиться, чтобы золото припаялось к медному проводу, второй конец которого при помощи сплава Вуда приводится в контакт с металлическим колпачком, закрывающим капилляр. При этом провода, находящиеся внутри капилляра, обездвиживаются, что предотвращает обрыв золотого микропровода при работе с ним.

Затем производят подготовку рабочей поверхности микродискового электрода. Оиа состоит в последовательном шлифовании его торца на все более тонких абразивных шкурках. Заключительную стадию, полировку микроэлектрода, целесообразно проводить на фетре с использованием порошка плазменной двуокиси циркония. Качество подготовки рабочей поверхности контролируется при помощи микроскопа. Видимая поверхность микродискового электрода должна иметь форму круглого диска без каверн и пустот по его периметру. По окончании полировки микроэлектрод тщательно промывается в четыреххлористом углероде и спирте. Эта операция производится для удаления с рабочей поверхности электрода загрязнений, могущих привести к изменению перенапряжения восстановления кислорода и снижению величины предельного тока. Поэтому на первом этапе работы необходимо проверить микродисковый электрод и выбрать потенциал, при котором в дальнейшем будет проводиться определение фотоиндуциро-ванного выделения кислорода.

Супернатант, полученный после осаждения суспензии микроводорос^ лей на центрифуге, заливают в ячейку. После ее сборки в режиме линейного изменения поляризации записывают кривую /—ф. Для обеспечения стационарного характера этой кривой скорость развертки не должна превышать значений, определенных О. С. Ксен-жеком и Г. А. Лобачем (1982).

Типичная стационарная поляриза-

Максималыше скорости развертки потенциала в зависимости от размера рабочей поверхности микро-электрода

Радиус рабочей поверхности микродискового электрода, мкм Максимальная скорость развертки потенциала, В.с-1

1 20

5 0,8

Ю 0,2

50 0,00» Рис. 73. Типичная стационарная поляризационная кривая восстановления растворенного кислорода иа микродисковом электроде диаметром 100 мкм. Скорость развертки потенциала — 5 мВ/с.

-0,8 -1,2<р,в ционная кривая золотого

микродискового электрода приведена на рис. 73. Рабочее значение поляризации выбирается в области предельного тока восстановления кислорода. Как видно из рисунка, величина предельного тока равна 4,75Х10-8 А. Подставляя это значение в формулу (56), можно рассчитать концентрацию кислорода, растворенного в супернатанте.

Полученная величина (2,23-10~4 М-л-1) довольно близко совпадает со значением насыщающей концентрации кислорода в водном растворе (2,4-10—4 М-л-1). Если эти величины значительно отличаются, необходимо обновить рабочую поверхность микродискового электрода и повторить измерение.

Лабораторная работа № 21.

Измерение светоиндуцированного выделения кислорода в

страница 74
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Структура и функции мембран" (2.22Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(09.12.2019)