Биологический каталог




Структура и функции мембран

Автор В.К.Рыбальченко, М.М.Коганов

ия клеток используют вращающиеся ножевые гомогенизаторы.

Выделение плазматических мембран и мембран аппарата Гольджи требует применения мягких условий гомогенизации для предотвращения чрезмерного разрушения этих мембран и получения в конечном счете крупных мембран1 ных фрагментов. Авторы некоторых методик предпочитают жесткие условия для получения мембранных фрагментов и пузырьков, которые при определенных обстоятельствах удается легче отделить от загрязнений. Следует иметь в виду, что двухвалентные катионы оказывают сильное воздействие на механическую целостность клеток и дальнейшее морфологическое состояние мембран. Важно отметить, что превышение критического уровня концентрации двухвалентных катионов ведет к необратимой агглютинации всех органелл.

Везикулярные фракции ПМ выделяют из осадка, полученного при высоких g. Осадки обычно насыщены одним илн несколькими основными видами внутриклеточных органелл и органелл, специфических для данного типа клеток. Степень насыщения зависит от условий гомогенизации (способа измельчения тканей, ионной силы, рН, концентрации двухвалентных катионов), скорости, времени и среды центрифугирования.

Одним из наиболее распространенных методов получения плазматических мембран является седиментация. Седиментация — общий термин для обозначения движения частицы в поле центробежной силы. Скорость седиментации сферических частиц зависит от плотности и радиуса самих частиц, а также от вязкости среды суспендирования. Время, необходимое для осаждения сферической частицы в жидкой среде от мениска жидкости до дна центрифужной пробирки, обратно пропорционально скорости седиментации и определяется следующим уравнением:

1 =1Г" 2mV*(р,-р) ~г~7~' *58)

где t — время седиментации в секундах; q — ускорение; w — угловая скорость ротора; ц — вязкость среды; г — радиус частицы; рг — плотность частицы; р — плотность среды; гм — расстояние от оси вращения до мениска жидкости; гд — расстояние от оси вращения до дна пробирки.

Смесь гетерогенных, относительно сферических частиц, различающихся по плотности и (или) размерам, можно разделить либо за счет разного времени осаждения их на дно пробирки при данном ускорении, либо за счет равновесного распределения седиментирующих частиц вдоль пробирки, устанавливающегося через определенный промежуток времени. При разделении веществ необходимо учитывать и такие важные факторы, как плотность и вязкость среды. Из вышеуказанного следует, что более массивная частица или молекула будет стремиться двигаться быстрее, чем менее массивная; более плотная частица (т. е. обладающая малым парциальным удельным объемом) движется быстрее, чем менее плотная; чем больше плотность раствора и коэффициент трения, тем медленнее будут двигаться в нем частицы.

Существующими методами можно разделять клеточные органеллы из гомогенатов тканей. Основные компоненты клетки осаждают в следующей последовательности: целые клетки и их фрагменты, ядра, митохондрии, лизосомы, микротельца, микросомы (в основном фрагменты гладкой и шероховатой эндоплазматической сети, ПМ и др.), отдельные типы мембранных структур.

В процессе поддержания ионных градиентов в клетках наибольший интерес представляет активный транспорт ионов против градиента концентрации. Создание и поддержание посредством активного транспорта ионных градиентов в клетках сопровождаются увеличением свободной энергии, что обусловливает сопряжение активного транспорта ионов с самопроизвольной экзергонической реакцией. Так, хорошо изученный активный транспорт ионов Na+ и К+ непосредственно сопряжен с реакцией гидролиза АТФ Mg2+-3aBHCHMOH, Na+, К+-активируемой АТФ-азой плазматической мембраны.

Для изучения трансмембранных процессов ионного обмена в клетках неисчерченных мышц исходно необходимо получить максимально чистую фракцию их ПМ. Мы попытались получить ПМ тонких кишок кролика для изучения роли плазмалеммы в поддержании внутреннего ионного состава клетки, в первую очередь ионов кальция, имеющего непосредственное отношение к процессам сокращения и расслабления неисчерченной мышцы. В процессе разработки методики выделения ПМ принимали во внимание последние работы в этом направлении.

Оборудование: гомогенизатор, ультрацентрифуга (типа УЦП-65 с набором роторов), спектрофотометр, лабораторная посуда.

Материалы и реактивы: сахароза, этилендиаминтетра-ацетат; дитиотреитол; имидазол-HCl; выделенные плазматические мембраны; 0,4 н. раствор NaOH; 2 %-й раствор ЫагСОз; 2 %-й раствор тартрата натрия; 1 %-й раствор CuS04; реактив Фолина; 10 %-й раствор гидроксида натрия (не содержащий примеси карбонатов, для чего готовится разведением 75 %-го раствора гидроксида натрия, в котором карбонаты нерастворимы, в прокипяченной дистиллированной воде, свободной от С02); сульфат меди CuS04X Х5НгО; тартрат натрия-калия (сегнетова соль) КООС— —СНОН—СНОН—COONaX4H20; йодид калия.

Лабораторная работа № 22. Выделение плазматических мембран неисчерченных мышечных клеток

Ход работы. Все операции в период выделения мембран проводят при температуре 1—4°С. Выделенные тонкие кишки кролика промывают холодной бидистиллированной водой, очищают от соединительной ткани и соскабливают слизистую. В опыте используют 50—.60 г ткани от двух животных. Очищенную и нарезанную на кусочки ткань (1— 1,5 см) гомогенизируют с помощью гомогенизатора типа «Polytron» в течение 35—45. с. Среда гомогенизирования содержит: 0,25 М сахарозы; 0,1 М ЭДТА; 1 мМ дитиотре-итола (ДТТ); 5 мМ имидазола-HCl (рН=7,2). Исходный объем гомогената составляет 350 мл. Затем объем гомоге-ната доводят средой гомогенизирования до 550 мл и центрифугируют (см. схему на рис. 76) при 12000 g 20 мин (ротор РПУ-35, ультрацентрифуга УЦП-65). Надосадочную жидкость фильтруют через 3 слоя марли и центрифугируют 10 мин при 38 ООО g.

Первые две процедуры позволяют избавиться от фрагментов тканей, обрывков клеток и крупных ядерных органелл (ядер, митохондрий). Супернатант после второго центрифугирования фильтруют и центрифугируют 60 мин при 145 ООО g.

страница 76
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Структура и функции мембран" (2.22Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(12.11.2019)