Биологический каталог




Структура и функции мембран

Автор В.К.Рыбальченко, М.М.Коганов

Получений осадок ресуспендируют в среде гомогенизации и центрифугируют 120 мин при 95 000 g в ступенчатом (25 %, 30, 40 %) градиенте плотности сахарозы, содержащем 5 мМ имидазола-HCl (рН=7,2). Образовавшиеся белковые зоны, локализованные в верхних слоях растворов сахарозы, отбирают и разводят в 20—25 раз средой гомогенизирования и центрифугируют с целью концентрирования при 145 000 g в течение 60 мин (ротор РПУ-35). Супернатант отбрасывают, а осадок ресуспендируют в среде хранения, содержащей 25 % (по объему) глицерина, 0,2 мМ СаС12, 0,1 мМ ЭДТА, 5 мМ имидазола-HCl (рН = =7,2) и хранят при температуре от 0 до —5°С.

Гомогенат

20мин при/2000д

\OcadoK

ЮминприЗвОООд

Осадок

——| Супернатант

Фильтрация

бОминприШОООд

иупернатант —— Осадок

Ресуспеидирование

120минпри95000д

-" 30°/>рр сахарозы

Супернатант — Осадок

Фракция ПМ в среде хранения

Рис. 76. Схема получения плазматических мембран неис-черчеииых мышечных клеток. Пояснения в тексте

Рис. 77. Распределение ферментативных активностей по субклеточным фракциям:

Г — гомогенат; Мк — микросомы; /, 2, 3, 4 — фракции мембран, полученные соответственно иа 25-, 30-, 35- и 40 %-х растворах сахарозы; а — 5'-иуклеотидаза; б — процент ингибирования общей АТФ-азиой активности азидом натрия; в — Na. К —АТФ-аза; г — Mg — АТФ-аза

а\

в

Г Мк 1 имоль(Рв)

6. Величины энзиматических активностей -

мг (белка) • мин ких мембран неисчерченных мышечных клеток

плазматичес-

Величина

Активность Среда и способ определенна активности.

М±т

5' -Н уклеотндаз иая

Общая Mg2+, Na+, К+ — АТФ-азная

Mg2+— АТФ-азная

Na+, К+-иая

- АТФ-аз-

Mg2+, Са2+—АТФ-азная

50 мМ трис-HCl, рН=7,4—7,8; 1 мМ MgCI2; 4 мМ АМФ; 100— 500 мкг белка НОЮ мМ NaCl; 20 мМ КС1; 5 мМ MgCl2; 3 мМ АТФ; 100 мкМ оуабаниа, 1,5 мМ имидазол-HCl, рН=7,2 5 мМ MgCl2; Э мМ АТФ; 100 мкМ оуабаниа; 1,5 мМ имидазол-HCl, рН=7,2 По разности между Mg2+, Na+, К+ — АТФ-азиой и активности в присутствии 0,1 мМ оуабаина По приросту активностей при добавлении микромолярных концентраций CaCfe

142±13 Р<0,05

1350±77 Р<0,05

1200±67 Ж0.05

215±37 Р<0,05

3,75±45 Р<0,05

Хранение в среде с глицерином дает возможность не подвергать фракцию ПМ губительному влиянию процессов замораживания-размораживания. При таком хранении энзиматические активности ПМ, представленные на табл. 6, не изменялись длительное время. Количественно выход фракции ПМ определяют по концентрации белка.

На рис. 77 представлено распределение ферментативных активностей по субклеточным фракциям, полученным описанным методом. Как видно из рисунка, активность ферментов, являющихся маркерами ПМ, максимальны во фракциях, полученных на 35- и 30 %-м растворах сахарозы. Уровень ингибирования общей АТФ-азной активности азидом натрия, свидетельствующий о наличии митохондри-альных примесей, самый низкий для препаратов на 30 %-м растворе сахарозы. Исходя из этого для дальнейшей работы целесообразно выбирать фракцию ПМ, получаемую на 30 %-м растворе сахарозы.

Лабораторная работа № 23. Определение концентрации белка плазматических мембран

При выделении фракции мембран необходимо оценить количественно выход белка. Одним из наиболее распространенных и высокочувствительных методов определения концентрации белка признан метод Лоури (1951). Этот метод основан на измерении интенсивности окраски раствора в зависимости от концентрации белка. При развитии окраски белка с реактивами, используемыми в определении методом Лоури, осуществляются по меньшей мере две цветные реакции на белок. Одна из них — биуретовая реакция, которая происходит между пептидными (—С—N—) связями и ионами меди. Возникающая сине-фиолетовая окраска вызвана образованием комплексного соединения — биуре-тового медного комплекса (рис. 78).

Такое комплексное соединение претерпевает в щелочной среде полную енолизацию по схеме

Две молекулы диенольной формы биурета взаимодействуют с гидроксидом меди (II) и образуют комплексное соединение, в котором координационные связи образованы за счет электронных пар атомов азота иминных групп (рис. 79). Такие медные комплексы обладают преимущественно фиолетовой и синей окраской.

Вторая реакция — это реакция реактива Фолина с ти-розиновыми и цистеиновыми радикалами молекулы белка. Это реакция восстановления смеси фосфорно-вольфрамовой и фосфорно-молибденовой кислот (реактив Фолина) с образованием комплексного соединения синего цвета. Процессы, происходящие при восстановлении смеси фосфорно-вольфрамовой и фосфорно-молибденовой кислот, до конца не изучены. Полагают, что в реакции восстановления принимают участие комплексные соединения меди, возникшие при взаимодействии белка со щелочным раствором медного купороса. Эта реакция не очень специфична, но зато весьма чувствительна.

I. Метод Лоури позволяет вести определение белков сильно разбавленных растворов, где количество их выражено лишь десятками микрограммов.

Ход работы. Реактив Фолина готовят следующим образом. 100 г Na2W04X2H20 и 25 г Na2Mo04X2H20 растворяют в 700 мл воды в круглодонной колбе иа 1 л, снабженной пришлифованным холодильником Либиха. Прибавляют 50 мл 85 %-й фосфорной кислоты и 100 мл концентрированной соляной кислоты. Помещают в колбу несколько капилляров. Смесь кипятят в колбе с обратным холодильником в течение 10 ч. Далее прибавляют 150 г сульфата лития, 50 мл воды и несколько капель брома. Не пользуясь обратным холодильником, кипятят содержимое колбы в течение 15 мин для удаления избытка брома (под тягой). Раствор охлаждают, доводят водой до 1 л и фильтруют через стеклянный фильтр. Хранят реактив Фолина в химической посуде темного стекла.

Все реактивы, используемые для приготовления реактива Фолина, должны быть химически чистыми. На всех этапах приготовления реактива цвет реакционной смеси должен быть желтым. При наличии зеленого оттенка

страница 77
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Структура и функции мембран" (2.22Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.10.2019)