Биологический каталог




Структура и функции мембран

Автор В.К.Рыбальченко, М.М.Коганов

о трехмерной организации); в) в случае биологических объектов большие трудности связаны с сохранностью и контрастностью образца.

Приготовление биологических образцов для электронной микроскопии должно удовлетворять очень строгим требованиям: а) образец должен быть предохранен от высушивания в вакууме в колонне микроскопа и бомбардировки электронами; б) образец должен быть тонким, чтобы достаточное количество электронов достигало плоскости изображения без заметной потери энергии; в) для обеспечения контрастности образец должен быть окрашен.

Все методы исследования можно разделить на две большие группы: прямые и косвенные.

В случаях прямых методов в микроскопе исследуется сам объект в виде тонкой пленки или мельчайших частиц. В случае косвенных методов рассматривается не сам объект, а полученный с него отпечаток — реплика.

Оборудование: электронный микроскоп; ультрамикротом; термостат; набор химической посуды.

Материалы и химреактивы: -1. Фракция плазматических мембран. 2. Фосфатный буфер (рН = 7,2—7,4). 100 мл буфера готовится добавлением 65 мл 0,1 М Na2HP04 к 30 мл 0,1 М КН2Р04; затем, по каплям добавляя КН2РО4, доводят рН до нужного значения; для поддержания осмотич-ности на 100 мл буфера добавляют 1 г сахарозы. 3. 2,5 %-й глутаральдегид на фосфатном буфере. 4. Осмиевый фиксатор по Миллонигу. Фиксатор готовят, смешивая растворы С (5,4%-я глюкоза), Р (49,2 мл 5,1 %-го NaH2PO4+10,8 мл 5,5 %-го NaOH) и 5 частей Os04 в соотношении 1:4:5. 5. 1 %-й раствор уранилацетата или фосфорно-вольфрамо-вой кислоты. 6. Опорные сетки. 7. Пленки-подложки. 8. Фильтровальная бумага, пипетки, пинцеты. Лабораторная работа № 24.

Электронно-микроскопический анализ чистоты фракций плазматических мембран методом ультратонких срезов

Ход работы. Контроль чистоты фракций плазматических мембран с помощью электронного микроскопа производится методом негативного контрастирования и методом ультратонких срезов. Последний включает следующие этапы:

а) проводка материала для заливки в аралдит: фиксация, обезвоживание, пропитка и заливка в эпоксидную смолу;

б) получение ультратонких срезов;

в) контрастирование срезов;

г) просмотр срезов в микроскопе; фотографирование и получение рабочих фотоотпечатков.

Проводка материала для заливки в аралдит. Фиксирование исследуемого материала необходимо для того, чтобы свести к минимуму структурные изменения,, которые могут произойти на всех стадиях приготовления препарата. Наиболее широко распространенными фиксаторами в электронной микроскопии являются альдегиды и тетраокись осмия, действие которых сводится к образованию поперечных связей между молекулами ткани и образованию в ткани прочной сети. Чаще всего применяется двойная фиксация, состоящая из первичной фиксации в глут ар альдегиде и последующей фиксации в тетра-окиси осмия. Этот метод сочетает в себе преимущества обоих фиксаторов, поскольку альдегиды эффективнее связывают белки, а тетраокись осмия — липиды.

Фракцию плазматических мембран фиксируют в течение 1 ч при 4 °С в глутаральдегиде, затем промывают буфером (3 раза по 15 мин, 4°С) и фиксируют тетраокисью осмия 1,5 ч при 4 °С.

Чтобы приготовить из фиксированного материала достаточно тонкие для электронной микроскопии срезы, необходимо пропитать ткань заливочной средой, которая будет ее поддерживать и сведет к минимуму повреждения при резке. Чаще всего заливочные среды не смешиваются с водой, поэтому вода, содержащаяся в ткани, должна быть замещена каким-то веществом, способным смешиваться с заливочной средой. Лучше всего для этой цели подходит этиловый спирт, так как он менее всего повреждает ткаиь. Чтобы избежать механических повреждений вследствие изменения поверхностного натяжения, материал не переносят сразу в абсолютный спирт, а проводят по ряду возрас7. Разведение спиртов

Пример- Имеется 90°-й спирт, нужно получить 70°-й. Для этого находят вертикальный столбик ШУ-го спирта и на месте пересечения его с горизонтальным рядом 7Ю°-го спирта находят число 31,05. Следовательно, для получения 70°-го спирта к 1(00 мл 90°-го нужно добавить 31,05 мл воды.

тающей концентрации спиртов от 50 до 100 %, обычно достаточно 10-минутного пребывания в каждом из спиртов. Батарея спиртов различной концентрации приготавливается согласно табл. 7. 100 %-й спирт готовят путем добавления к 96 %-му спирту прокаленного медного купороса.

После этого материал обрабатывают жидкостью, которая смешивается и с этанолом, и с заливочной средой. Если для заливки применяются эпоксидные смолы, такой жидкостью служит ацетон. Затем ткань переносят в неполиме-ризованную заливочную среду, где она должна находиться до тех пор, пока полностью не пропитается этой средой (примерно 30 ч). Далее ткань опускают в свежую заливочную среду и проводят полимеризацию.

В качестве заливочной среды наиболее широкое применение иашли эпоксидные смолы (эпон, аралдит и др.), так как их использование позволило уменьшить сморщивание и повреждение ткани при полимеризации. Срезы тканн, заключенной в эпоксидную смолу, достаточно прочны, чтобы монтировать их на опорных сетках без пленки-подложки.

Рецепт смеси для заливки в аралдит. Готовится запасной раствор, представляющий собой 10 частей аралдита и 7 частей уплотнителя. Запасной раствор тщательно перемешивают, следя, чтобы в нем не было пузырьков воздуха. Заливочная среда готовится из запасного раствора и 1,5— 2 % катализатора, среда тщательно перемешивается.

Схема проводки материала для заливки в аралдит. -

1. Фиксация глутаральдегидным фиксатором — 4°С, 1 ч.

2. Промывка фосфатным буфером — 4 °С, 3 раза по 10 мин.

3. Осмиевая фиксация по Миллонигу— 1,5—2 ч, 4°С.

4. Обезвоживание:

70 %-й этанол — 4°С, 2 раза по 15 мин;

80%-й » 4 °С, 10 мин;

90%-й » 4 °С, 10 мин;

96%-й » 20 °С, 10 мин;

100 %-й этанол — 20 °С, 3 раза по 10 мин;

100%-й этанол+ацетон (3:1)— 20 °С, 10 мин;

100%-й —»— (1:3)—20 °С, 10 мин;

100 %-й ацетон — 20 °С, 10 мин.

5

страница 79
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Структура и функции мембран" (2.22Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.10.2019)