Биологический каталог




Структура и функции мембран

Автор В.К.Рыбальченко, М.М.Коганов

ых Са+2). 16. 10 мМ раствор оуабаина (если этого реактива недостаточно, можно в учебных целях использовать строфантин К или ванадат натрия). 17. Буферная смесь: N-мeтилглюкaмин-г-MgS04— 7 г/45 мл. 18. Субстрат: смесь диаммонийной соли п-нитрофенилфос-фата с глюкозой. 19. Ингибитор: 0,1 М комплексен III в 0,7 М гидроксиде натрия. 20. п-нитрофенол: 62,6 г/100 мл — для построения калибровочного графика. 21. Раствор 20 %-й НСЮ4. 22. 10-5 М раствор K3Fe(CN)6. 23.НАД-Н 1,5 мМ (31,5 мг в 3 мл буфера). 24. 1 М раствор имидазола (рН = = 7,0). 25. 1 М раствор КО. 26. 70 мМ раствор MgCl2. 27. 100 мМ раствор азида натрия. 28. 30 мМ раствор ЭДТА. 29. 20 мМ раствор оксалата калия. -30 30 мМ раствор АТФ. 31. Фосфатный буфер 0,20 М (Na2HP04, КН2Р04); рН = 7,2. а-нафтол — 0,036 %-й раствор. 33. Карбонат натрия — 0,05 %-й раствор. 34. Этиловый спирт (абсолютный).

35. 0,01 М фосфатный буфер (Na2HP04, КН2Р04); рН = 7,4.

36. 0,04 %-й раствор цитохрома с. 37. 0,4 %-й раствор диме-тилпарафенилендиамина гидрохлорида (ДФДА). 38. Тет-рахлорэтилен. 39. 0,5 М и 2,5 М растворы сукцината натрия или калия. 40. 5 %-й тритон Х-100. 41. 0,05 М раствор цианида калия (из-за значительной токсичности KCN рекомендуется использовать 10 мМ азид натрия). 42. 0,02 М раствор феназинметасульфата. 43. 0,001 М раствор 2,6-ди-хлорфенолиндофенола (последние два раствора приготавливаются в день опыта). 44. 0,15 М раствор азида натрия. 45. Раствор цитохрома с (4,4-10~5 М на 0,04 М фосфатном буфере — готовится перед опытом). 46. Водные растворы — А1С1з — 4-10-3 М и СаС12—4-.10-3 М — смешивают в равных объемах перед опытом. 47. 50 мМ водный раствор /г-нитро-фенилэтиламина (101 мг препарата растворяют в 10 мл во-ды). 48. n-бутиловый спирт. 49. 0,5 %-й водный раствор едкого натра. Лабораторная работа М 26.

Определение активности маркерных ферментов

плазматических мембран

/. Определение активности 5'-нуклеотидазы. 5'-нуклео-тидаза (5'-АМФ-аза К. Ф. 3. 1. 3. 5) —один из наиболее часто используемых маркеров для плазматических мембран. Фермент гидролизует аденозин-5'-монофосфат с образованием фосфорной кислоты и нуклеозида (рис. 86). Активный центр фермента расположен на наружной поверхности мембраны.

. Г2

С. N

I П сн

NH,

НС^ .с. /

ОН

но-р-о-сн2

II

о

\н н; он он

I ft сн нс^^.сч /

ОН

5'-АМФ-аза

НОСН2

ОН ОН

+ НО-Р-ОН

II

о

Рис. 86. Гидролиз аденозин-5'-монофосфата

Принцип метода заключается в определении количества неорганического фосфора, образовавшегося в результате гидролиза аденозин-5'-монофосфата (АМФ).

Ход работы. Готовят инкубационную среду на 10 мл, содержащую такие компоненты: 0,05 М трис-HCl, 1 мМ MgCU, 4 мМ АМФ. Затем разливают инкубационную смесь по 0,9 мл в каждую пробирку (на каждый опыт — 3 пробирки). В пробирку для контроля наливают 1 мл инкубационной среды. Все пробирки термостатируют 5—10 мин при 37 °С. После того, как в пробирках создается температура 37°С, инициируют реакцию добавлением суспензии белка по 0,1 мл из раствора с исходной концентрацией 500—1000 мкг/мл. Белок добавляют в каждую пробирку, кроме контроля, в определенной последовательности через 15 с.

Пробы инкубируют 10—15 мин при температуре 37 °С. По истечении времени инкубации реакцию останавливают добавлением во все пробы по 0,1 мл холодной 10 %-й ТХУ (в той же последовательности, в какой добавляли белок, строго по секундомеру с интервалом 15с).

Далее производят окрашивание проб для выявления количества неорганического фосфата, для чего во все пробирРис. 87. Калибровочный график для определения количества неорганического фосфора методом Фиске — Суббароу

ки разливают 0,5 мл 2,5 %-го мо-либдата аммония на 5 н. H2SO4, 0,5 мл 2 %-го раствора аскорбиновой кислоты (готовится непосредственно перед опытом) и 1 мл бидистиллировэнной воды.

Для развития оптимальной

__окраски пробы должны постоять

о ю ~ 20~ Р,мкг * 30 мин. Затем их центрифугируют 5—10 мин при 2000 об/мин, чтобы белок не мешал определению, супернатант колориметрируют при длине волны 680 нм против пробы, не содержащей белка.

Количество неорганического фосфора, образовавшегося в ходе ферментативной реакции, определяют колориметрически методом Фиске — Суббароу. Сущность его заключается в том, что фосфорная кислота образует с молибденовой кислотой комплексное соединение, которое легко восстанавливается различными восстановителями с образованием окрашенной в синий цвет молибденовой сини. Образовавшийся раствор синего цвета той или иной интенсивности сравнивают со стандартным раствором соли фосфорной кислоты, который подвергают той же самой процедуре.

Для построения калибровочного графика взвешивают 0,1099 г КН2Р04, высушенного в эксикаторе, и растворяют в 100 мл воды, 1 мл такого раствора содержит 250 мкг Рн. Разливают раствор в пробирки таким образом, чтобы в 1 мл содержалось, мкг: 2,5; 5; 7,5; 10; 15; 20; 25; 50.

Затем проводят процедуру окрашивания, для чего во все пробирки прибавляют: 1 мл 10 %-й ТХУ; 0,5 мл 2,5 %-го молибдата аммония на 5 н. H2SO4; 0,5 мл 2 %-й свежеприготовленной аскорбиновой кислоты; 1 мл НгО.

Для развития окраски пробы стоят 30 мин, а затем колориметрируются при длине волны 680 нм против пробы, содержащей окрашивающие компоненты, но не содержащей КН2РО4. Строят калибровочную кривую, пример которой представлен на рис. 87.

Для определения активности фермента необходимо знать калибровочный коэффициент (К), который рассчитывается так: Е (в абсолютных величинах для определенной коиц.)

^ С (значение концентрации) (^)

0,220

Пример из представленного графика: К=-——=0,030.

Расчет активности 5'-нуклеотидазы, выраженной в имоль (Рн)

——-—-.производят по формуле

мг (белка) X мин r -г г j

Д?1000-1000 нмоль (Р„)

Kj3U мг(белка)-мин ' №®)

где АЕ — изменение экстинции; 1000 — пересчет на мг белка; К — калибровочный коэффициент; 31 — молекулярная масса фосфора; / — количество белка в пробе (50—100 м

страница 83
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Структура и функции мембран" (2.22Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.10.2019)