ан на измерении снижения оптической плотности (при к = 600 нм) 2,6-дих-лорфенолиндофенола (ДХФИФ), восстанавливающегося в присутствии феназинметасульфата (ФМС) при ферментативном окислении сукцината (рис. 91).

В пробирки (конечный объем — 4 мл) вносят определенные объемы растворов буфера, ЭДТА, сукцината натрия, цианида калия или азида натрия, ДХФИФ, 0,1—0,2 мг белка в 0,1—0,2 мл и перемешивают. Не следует заблаговременно смешивать растворы сукцината, феназинметасульфата и ДХФИФ, так как может произойти неферментативное восстановление последнего. Инкубационная среда должна содержать такие компоненты: 10 ;мМ фосфатного буфера (рН=7,4); 10 мМ раствор сукцината калия; 0,1 мМ раствор ЭДТА; 1 мМ азида натрия; 0,05 мМ раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола; 0,1—0,2 мг белка (рекомендуется к раствору белка добавить тритон Х-100 до концентрации 1 % для разрушения митохондрий и доступности субстрата для фермента).

Смесь перемешивают, переливают в кювету и измеряют оптическую плотность при 600 нм. Затем добавляют фена-зинметасульфат до его концентрации 1,8 мМ и измеряют оптическую плотность через каждые 15 с в течение 2 мин HOOC-CHa-CH^-COOH^ ФАД Цитохром с

\У \/ (восстановленный)

ноос н Y Y

С=Сч /\ /\ Цитохром с

Н СООН -—у ^ФАД-Н2"^ v-— (окисленный)

Рис. 92. Восстановление цитохрома с

против среды без ФМС и без 2,6-ДХФИФ. Аналогичным образом измеряют оптическую плотность в пробах со средой, не содержащей сукцината.

При расчете истинной активности величины эндогенной активности вычитают из величин, выражающих активность сукцинатдегидрогеназы в пробах, содержащих сукцинат (Д?=А-Еобщ — АЕавяог).

Для расчета активности сукцинатдегидрогеназы используют величину снижения оптической плотности (в ходе ферментативной реакции) за 1 мин на 1 мг белка. Активность выражают в наномолях окисленного сукцината, учитывая, что снижение оптической плотности на единицу эквивалентно восстановлению 60 нмоль 2,6-ДХФИФ, а количество восстановленного красителя пропорционально количеству окисленного сункцината.^

Метод II. Ход работы. Активность сукцинатдегидрогеназы можно определить по восстановлению цитохрома с. Метод основан на изменении экстинкции при восстановлении цитохрома с. Ход процесса показан на схеме (рис. 92).

Вследствие того что цитохромоксидаза расположена на внутренних мембранах митохондрий и недоступна для субстрата — эндогенного цитохрома с, исследуемую фракцию мембран рекомендуется подвергать различным способам обработки: гипотоническому шоку, замораживанию и оттаиванию, 10—15-минутной преинкубации в растворе детергента (дезоксихолате натрия 1 %, тритоне Х-100 0,1 %).

В кювету помещают 100—200 мкг в 0,1 мл белка и добавляют 0,1 мл сукцината натрия. Смесь тщательно перемешивают и инкубируют 2—3 мин при комнатной температуре. К смеси добавляют 0,1 мл раствора азида натрия, а через 1 мин 0,3 мл смеси А1С1з и СаС12 и сразу же добавляют 2,5 мл раствора цитохрома с.

Изменение экстинкции, происходящее при восстановлении цитохрома с, регистрируется на спектрофотометре при 550 нм через каждые 15 с в течение 3 мин. В конце определения в пробу добавляют гидросульфит натрия до полного восстановления цитохрома с, о чем свидетельствует прекращение роста оптической плотности. В контроле присутствуют все компоненты, кроме белка.

9* Разность оптической плотности до и после ферментативного восстановления цитохрома с (Д?), отнесенная к 1 мг белка, является мерой цитохром с-сукцинатдегидрогеназной активности.

Д?0бщ—Д?Эн дог) 1000 Д?в5о

3/ мг(белка)-мин

где /—количество внесенного белка (мкг); 1000 — пересчет на 1 мг; 3 — время регистрации оптической плотности (мин); А?б5о — разность оптической плотности до и после ферментативного восстановления цитохрома с.

3. Определение активности моноаминоксидазы (К.Ф.1. 4.3.4). Моноаминоксидаза митохондрий катализирует реакцию окислительного дезаминирования:

R — СН2 — СН2 — NH2 + 02 + Н20 ЯСНзСНО + + Шз + Н202.

В основе рассматриваемого метода лежит изменение количества образовавшегося альдегида при ферментативном дезаминировании л-нитрофенилэтиламина. Образовавшийся окрашенный продукт желто-оранжевого оттенка с максимумом поглощения % = 450 нм в сильно щелочной среде экстрагируют га-бутанолом. Указанный окрашенный пигмент представляет собой продукт конденсации п-нитро-фенилацетальдегида (продукта окислительного дезаминирования га-нитрофенилэтиламина) с избытком.этого амина.

По нарастанию оптической плотности при длине волны 450 нм судят о ферментативной активности моноаминоксидазы. Метод отличается высокой чувствительностью и хорошей воспроизводимостью.

Ход работы. В пробирки (на одно определение требуется три пробирки), снабженные шлифом, вносят по 1 мл исследуемого материала (исследуемая фракция мембран), добавляют 1 мл 0,2 М

Рис. 93. Зависимость между количеством аммиака, освобождаемого при дезаминировании п-нитрофенилэтиламииа митохондриями печеии крысы и оптической плотностью бутанолового экстракта параллельных проб.

На реи ординат — оптическая плотность при 440 нм; на оси абсцисс — количество аммиака в пробе в наномолях фосфатного буфера, 0,1 мл 50 мМ раствора л-нитрофенил-этиламина и воды до объема 3 мл. В контрольную пробирку вместо исследуемого материала доливают воду. Пробы тщательно перемешивают и помещают в термостат при 37 °С на 45 мин. Сразу после окончания инкубации реакцию дезаминирования л-нитрофенилэтиламина инактиви-руют добавлением в пробы 0,5 %-го раствора едкого натра до рН = 10,0; рН контролируют по изменению цвета индикаторной бумаги. Затем в пробирки вносят по 4 мл л-бу-танола, закрывают их притертыми пробками и сильно встряхивают в течение 1 мин. |

Содержимое пробирок переносят в полиэтиленовые центрифужные пробирки и центрифугируют 5 мин при 4000g. Верхнюю бутаноловую фазу осторожно переносят в кювету и измеряют оптическую плотность образца против бутано-ловой фазы, полученной при аналогичной обработке контрольной пробы. Чем больше моноаминоксида