Биологический каталог




Структура и функции мембран

Автор В.К.Рыбальченко, М.М.Коганов

зная активность исследуемого материала, тем выше измеряемые величины оптической плотности. Активность моноаминокси-дазы выражают в наномолях освобожденного аммиака на 1 мг белка в 1 мин. Для расчета рекомендуется использовать калибровочный график для перевода величины оптической плотности бутанолового экстракта в микромоли аммиака, освобождающегося при реакции окислительного дезаминирования л-нитрофенилэтиламина. График постро-_ ен на основе сравнения измерения моноаминоксидазной активности вышеописанным способом (рис. 93).

Для расчета моноаминоксидазной активности из точки на оси ординат, соответствующей оптической плотности исследуемого образца проводят прямую, параллельную оси абсцисс, до пересечения с калибровочной кривой. Из точки пересечения этих двух линий проводят прямую до оси абсцисс. Значение, полученное на оси абсцисс, используют для пересчета моноаминоксидазной активности исследуемо-

го образца в JIZJ^L

Контрольные вопросы

1. Примеси каких органелл присутствуют во фракции митохондрий? Как это установить? Чем обусловлено присутствие этих примесей? 2. Чем могут быть обусловлены артефакты при определении маркерных ферментов митохондрий? 3. На чем основано определение активности цито-хромоксидазы, сукцинатдегидрогеназы, моиоамииоксидазы? Какую роль выполняют этн ферменты в мембранах митохондрий? 3.13. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛИПИДНОГО СОСТАВА ПЛАЗМАТИЧЕСКИХ МЕМБРАН

К липидам мембран относятся главным образом амфи-патические липиды. Это липиды, молекула которых состоит из полярной головки и длинного гидрофобного хвоста, образованного ацильными остатками жирных кислот. Гидрофильные и гидрофобные части молекул липидов резко отличаются между собой в отношении действия внешних факторов. Например, при повышении температуры полярные головки остаются практически неизменными, гидрофобные — «плавятся».

Фосфолипидам мембран свойственны как лиотропный, так и термотропный мезоморфизм. Лиотропный мезоморфизм липидов следует понимать как существование нескольких различных типов агрегатов липида в воде. Если концентрация липида в воде превышает 1 %, то липидные молекулы находятся в среде в виде мицелл и свободноплавающих молекул. Чем больше концентрация липида в воде, тем больше мицелл, чем выше температура — при той же концентрации липида — равновесие сдвигается в сторону образования свободных липидных молекул. Кроме того, с увеличением концентрации липида в воде изменяется и форма мицелл: шарообразные, цилиндрические и ламелляр-ные структуры.

Термотропный мезоморфизм — это изменение состояния липидной фазы при изменении температуры. При физиологических температурах почти все липиды мембран находятся в виде ламеллярной структуры. (На этом, кстати, и основаны последние модели структуры биологических мембран; см. 1.3.) Как правило, липиды в биологических мембранах имеют мезоморфные фазы, в которых гидрофобные цепи принимают беспорядочные конформации; такие фазы называются жидкокристаллическими.

В жидкокристаллической фазе липид может выполнять кроме барьерной и многих других функций в мембране еще одну очень важную. Эта функция заключается в регуляции активности почти всех мембранно-связанных ферментов. Эта регуляция, как предполагается, осуществляется двояко:

а) изменение геометрии молекулы фермента за счет гидрофобных взаимодействий так, что активный центр фермента становится доступным субстрату. Поэтому переходы липидов из одной мезоморфной фазы в другую существенно изменяют активность мембранных ферментов и функцию отдельных органелл и клетки в целом; б) возможно, липиды способствуют образованию муль-тимолекулярных ферментативных комплексов, что обеспечивает пространственную и временную организацию биохимических и физико-химических процессов в клетке.

Полная регуляция активности белков-ферментов липидами не может быть осуществлена только гидрофобными белок-липидными взаимодействиями. Во взаимодействии молекул белков и липидов помимо гидрофобных взаимодействий между ацильными остатками молекулы липида и неполярными группами белковой молекулы принимают участие и другие. Это ионные взаимодействия, водородные связи, связи с образованием «мостиков» через двухвалентные катионы и др.

Липиды мембран чрезвычайно разнообразны по характеру и составу. Содержание липидов в мембранах колеблется от 25 до 70—80 % по массе. В 70—80 гг., благодаря развитию хроматографического, спектроскопического и изотопного методов исследования в изучении липидов достигнуты большие успехи.

Препараты мембран, предназначенные для анализа липидов, необходимо защищать от автоокисления и расщепления протеолитическими и липолитическими ферментами. Для этой цели рекомендуется проводить обработку быстро, при низкой температуре и при определенной ионной силе и рН, а также защищать препарат от вспенивания и интенсивного контакта с кислородом. В настоящее время используется эффективный и быстрый метод выделения и очистки липидов в мягких условиях. Для экстракции используют смесь метанола и хлороформа, которая разрушает липопротеидные комплексы и тем самым дает возможность достаточно полно извлечь липиды.

Добавляя в гомогенат избыток хлороформа и воду, получают двухфазную систему, которую легко разделить. Слой хлороформа содержит растворенные в нем липиды, нелипидных примесей в нем практически нет. Потеря липидов со слоем метанол — вода незначительна. Метод предложен Д. Фолчем (1957).

Оборудование: 1. Аппарат для встряхивания; весы технические; термостат на 105°С; водяная баня; гомогенизатор. 2. Аппаратура для тонкослойной хроматографии; шкаф сушильный на 120 °С. 3. Роторный вакуумный испаритель.

Материалы и химреактивы: 1. Выделенная фракция плазматических мембран. 2. Метанол; хлороформ; ацетат цинка (2 %). 3. Силикагель, гипс, гексан, диэтиловыйэфир, уксусная кислота (ледяная), фосфорно-молибденовая кислота (10 %-ная), 1 М раствор КС1. Лабораторная работа № 29.

Выделение липидов плазматических мембран

клеток неисчерченных мышц кролика

Ход работы. Мембраны гомогенизируют в 5

страница 88
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Структура и функции мембран" (2.22Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.10.2019)